Coronavirus replication-transcription complex: NMPylation ທີ່ສໍາຄັນແລະເລືອກຂອງຫນ່ວຍຍ່ອຍ NiRAN-RdRp ກັບສະຖານທີ່ອະນຸລັກໃນ nsp9

ແກ້ໄຂໂດຍ Peter Sarnow, ໂຮງຮຽນແພດສາດມະຫາວິທະຍາໄລສະແຕນຟອດ, ມະຫາວິທະຍາໄລສະແຕນຟອດ, ຄາລິຟໍເນຍ, ອະນຸມັດໃນວັນທີ 25 ທັນວາ 2020 (ທົບທວນຄືນວັນທີ 25 ຕຸລາ 2020)

ພວກເຮົາລາຍງານປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງຫນ່ວຍຍ່ອຍໃນການຈໍາລອງຂອງສະລັບສັບຊ້ອນການຖອດຂໍ້ຄວາມຈາກ coronaviruses, ເຊິ່ງເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບການຈໍາລອງແລະການອະນຸລັກວິວັດທະນາການ.ພວກເຮົາໄດ້ໃຫ້ຫຼັກຖານວ່າໂດເມນ NiRAN ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ nsp12 ມີກິດຈະກໍາຂອງ nucleoside monophosphate (NMP) transferase ໃນ trans, ແລະໄດ້ກໍານົດ nsp9 (ເປັນທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດ RNA) ເປັນເປົ້າຫມາຍຂອງມັນ.NiRAN ກະຕຸ້ນການຍຶດຕິດຂອງ covalent ຂອງ moiety NMP ກັບ terminus nsp9 amino ທີ່ຖືກອະນຸລັກໃນປະຕິກິລິຍາທີ່ອີງໃສ່ Mn2+ ions ແລະ residue Asn ທີ່ຖືກອະນຸລັກທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ.ມັນໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າກິດຈະກໍາ NiRAN ແລະ nsp9 NMPylation ເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບການຈໍາລອງການຈໍາລອງໂຣກ coronavirus.ຂໍ້ມູນດັ່ງກ່າວອະນຸຍາດໃຫ້ພວກເຮົາເຊື່ອມຕໍ່ກິດຈະກໍາຂອງເຄື່ອງຫມາຍ enzyme ເຊື້ອໄວຣັສ nested ກັບຂໍ້ສັງເກດທີ່ຜ່ານມາໃນການສົມມຸດຕິຖານວ່າການເລີ່ມຕົ້ນຂອງການສັງເຄາະ RNA ໃນຫ້ອງຮຽນຂອງໄວຣັສ RNA ແມ່ນປະຕິບັດຫນ້າແລະ evolutionarily ສອດຄ່ອງ.

RNA-dependent RNA polymerase (RdRps) ຂອງ Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ແລະ 12 ຄອບຄົວອື່ນໆ) ແມ່ນເຊື່ອມຕໍ່ກັບໂດເມນ amino-terminal (N-terminal) ໃນທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ມີໂຄງສ້າງ (nsp) ປ່ອຍອອກມາຈາກ polyprotein, ເອີ້ນວ່າ NiRAN. 1ab ແມ່ນປະກອບດ້ວຍ protease ຕົ້ນຕໍໄວຣັສ (Mpro).ກ່ອນຫນ້ານີ້, ເຊື້ອໄວຣັສ arterial NiRAN-RdRp nsp ຂອງກິດຈະກໍາ GMPylation / UMPylation ຂອງຕົນເອງໄດ້ຖືກລາຍງານ, ແລະມັນໄດ້ຖືກແນະນໍາໃຫ້ສ້າງ transient ສໍາລັບການໂອນ nucleoside monophosphate (NMP) ໄປຫາເຊື້ອໄວຣັສ (ປະຈຸບັນບໍ່ຮູ້ຈັກ) ແລະ / ຫຼືສິ່ງຂອງ biopolymerization ຈຸລັງ.ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂຣກ coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E ແລະ Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ມີກິດຈະກໍາ NMPylation ທີ່ຂຶ້ນກັບ Mn2+, ເຊິ່ງໄດ້ມາຈາກ nsp9 ໂດຍຜ່ານການສ້າງ Mpro-mediated nsp9 ຫຼັງຈາກ. N-terminal flanking nsps ຖືກປ່ອຍອອກມາໂດຍ proteolytically, phosphoramidate ຖືກຜູກມັດກັບ amine ປະຖົມ (N3825) ທີ່ N-terminal ຂອງ nsp9.Uridine triphosphate ແມ່ນ nucleotide ທີ່ຕ້ອງການໃນປະຕິກິລິຍານີ້, ແຕ່ adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, ແລະ cytidine triphosphate ຍັງເປັນສານຍ່ອຍທີ່ເຫມາະສົມ.ການສຶກສາການກາຍພັນໂດຍໃຊ້ທາດໂປຼຕີນຈາກໂຣກ coronavirus nsp9 ແລະ nsp12 ທີ່ປະສົມກັນແລະສານພັນທຸກໍາທີ່ສ້າງຂື້ນມາໄດ້ກໍານົດສານຕົກຄ້າງທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບ NMPylation NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ແລະການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສໃນວັດທະນະທໍາເຊນ.ຂໍ້ມູນໄດ້ຢືນຢັນການຄາດຄະເນຂອງ NiRAN residues ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວແລະກໍານົດບົດບາດສໍາຄັນຂອງ residues nsp9 N3826 ໃນ nsp9 NMPylation ແລະການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສໃນ vitro.ສານຕົກຄ້າງນີ້ແມ່ນສ່ວນໜຶ່ງຂອງລຳດັບ NNE tripeptide N-terminal ທີ່ຖືກອະນຸລັກໄວ້ ແລະໄດ້ພິສູດວ່າເປັນສານຕົກຄ້າງອັນດຽວຂອງ nsp9 ແລະ homologs ຂອງມັນຢູ່ໃນຄອບຄົວໂຣກ coronavirus.ການສຶກສານີ້ສະຫນອງພື້ນຖານທີ່ຫນັກແຫນ້ນສໍາລັບການສຶກສາທີ່ເປັນປະໂຫຍດຂອງກິດຈະກໍາ NMPylation ຂອງໄວຣັສຮັງອື່ນໆແລະສະເຫນີເປົ້າຫມາຍທີ່ເປັນໄປໄດ້ສໍາລັບການພັດທະນາຢາຕ້ານໄວຣັດ.

Nidovirales positive-stranded RNA virus infects a variety of vertebrates and invertebrates (1, 2).ຄໍາສັ່ງປະຈຸບັນປະກອບມີ 14 ຄອບຄົວ (3), ໃນນັ້ນຄອບຄົວ Coronavirus ໄດ້ຮັບການສຶກສາຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນ 20 ປີທີ່ຜ່ານມາ.ໃນເວລານັ້ນ, ໂຣກ coronaviruses zoonotic ສາມໂຕໄດ້ອອກມາຈາກເຈົ້າພາບສັດແລະເຮັດໃຫ້ເກີດການລະບາດຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງການຕິດເຊື້ອທາງເດີນຫາຍໃຈຮ້າຍແຮງໃນມະນຸດ.ລວມທັງການແຜ່ລະບາດຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງທີ່ເກີດຈາກພະຍາດຕິດຕໍ່ທີ່ຮ້າຍແຮງ.ໂຣກລະບົບຫາຍໃຈ Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruses ແບ່ງປັນອົງການຈັດຕັ້ງ genome ທົ່ວໄປ, ແລະ subunit ຂອງ membrane-bound replication-transcription complex (RTC) ຖືກເຂົ້າລະຫັດຢູ່ໃນ 5-?²-terminal ສອງສ່ວນສາມແລະ subunit ໂຄງສ້າງຕົ້ນຕໍຂອງອະນຸພາກເຊື້ອໄວຣັສ, ເຊັ່ນດຽວກັນກັບອຸປະກອນເສີມບາງຢ່າງ. .ທາດໂປຼຕີນ, ເຂົ້າລະຫັດຢູ່ໃນ 3??² ທ້າຍທີສາມຂອງ genome (1).ຍົກເວັ້ນຄອບຄົວຫນຶ່ງຂອງເຊື້ອໄວຣັສ planarian (Monoviridae) (8), ໄວຣັສທີ່ວາງໄວ້ທັງຫມົດ encode RTC subunits ໃນສອງກອບການອ່ານເປີດຂະຫນາດໃຫຍ່ (ORF) ORF1a ແລະ ORF1b, ເຊິ່ງແປຈາກ RNA genomic ຂອງ.ORF1a ເຂົ້າລະຫັດ polyprotein (pp) 1a, ແລະ ORF1a ແລະ ORF1b ຮ່ວມກັນເຂົ້າລະຫັດ pp1ab.ດ້ວຍການມີສ່ວນຮ່ວມທົ່ວໄປຂອງ protease ຕົ້ນຕໍ (Mpro) ທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດໂດຍ ORF1a, ທັງ pp1a ແລະ pp1ab ຖືກປຸງແຕ່ງ proteolytically ເຂົ້າໄປໃນຄວາມຫລາກຫລາຍຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ມີໂຄງສ້າງ (nsps), ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ 3CLpro, ເພາະວ່າມັນມີ homology ກັບ 3Cpro ຂອງ picornavirus (. 9).nsps ເຫຼົ່ານີ້ຖືກຄິດວ່າຈະປະກອບເຂົ້າໄປໃນ RTC ແບບເຄື່ອນໄຫວຂະຫນາດໃຫຍ່, catalyze ການສັງເຄາະຂອງ RNA genomic (replication) ແລະຊຸດຂອງ subgenomic RNA (transcription), ແລະຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະສານງານການສະແດງອອກຂອງ ORF ຕັ້ງຢູ່ລຸ່ມນ້ໍາຂອງ ORF1b (10 ? ?12).

RTC ຫຼັກປະກອບມີ RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) ແລະ enzymes ປຸງແຕ່ງ RNA ຫຼາຍຊະນິດ, ເຊິ່ງສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຖືກເຂົ້າລະຫັດໃນ ORF1b ແລະໃນຄອບຄົວໂຣກ coronavirus ມັນປະກອບດ້ວຍ nsp12-nsp16 ແລະ. nsp9-nsp12 ໃນຄອບຄົວ Arterioviridae (ເບິ່ງເອກະສານອ້າງອີງ 10ââ 12).RdRp ແລະ HEL1 ເປັນຕົວແທນຂອງສອງ (ຫນຶ່ງສ່ວນຫ້າ) ໂດເມນທີ່ຖືກອະນຸລັກຂອງເຊື້ອໄວຣັສຮັງນົກແລະມີ homology ໃນບັນດາໄວຣັສ RNA ອື່ນໆ.ການຈໍາລອງຫຼັກແມ່ນເຊື່ອວ່າໄດ້ຮັບການຊ່ວຍເຫຼືອຈາກຫນ່ວຍຍ່ອຍອື່ນໆ, ລວມທັງ nsps ຂະຫນາດນ້ອຍຈໍານວນຫນຶ່ງທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກພາກພື້ນ carboxy-terminal (C-terminal) ຂອງ pp1a, ລຸ່ມນ້ໍາຂອງ Mpro (coronavirus nsp5 ແລະເຊື້ອໄວຣັສ arterial nsp4, ຕາມລໍາດັບ).ເຂົາເຈົ້າມີການປົກປ້ອງສະເພາະໃນຄອບຄົວຈໍາກັດ ແລະກິດຈະກໍາທີ່ຫຼາກຫຼາຍ (ທົບທວນຄືນໃນເອກະສານອ້າງອີງ10ââ12).

ຂ້ອນຂ້າງບໍ່ດົນມານີ້, ໂດເມນທີ່ມີລັກສະນະ motif ລໍາດັບທີ່ເປັນເອກະລັກໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ທີ່ປາຍ amino (N-terminus) ຕິດກັບ RdRp ໃນທຸກໄວຣັສທີ່ຖືກວາງໄວ້, ແຕ່ບໍ່ມີໄວຣັສ RNA ອື່ນໆ (16).ອີງຕາມສະຖານທີ່ຂອງມັນແລະກິດຈະກໍາຂອງ nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), ໂດເມນນີ້ມີຊື່ວ່າ NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).ການປະສົມປະສານສອງໂດເມນຂອງ NiRAN-RdRp ປະກອບເປັນ nsp12 ໃນຄອບຄົວ Coronaviridae ແລະ nsp9 ໃນຄອບຄົວ Arterioviridae, ແລະໃນ nestoviridae ອື່ນໆ, NiRAN-RdRp ຄາດວ່າຈະຖືກປ່ອຍອອກມາເປັນ nsp ເອກະລາດຈາກ polyprotein ໄວຣັດ.ໃນໂຣກ coronavirus, ໂດເມນ NiRAN ມີ ??1/450 residues ແລະເຊື່ອມຕໍ່ກັບໂດເມນ C-terminal RdRp ຜ່ານພາກພື້ນເຊື່ອມຕໍ່ (16?19).ໃນ Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), recombinant nsp9 ສະແດງໃຫ້ເຫັນກິດຈະກໍາ Mn2+ ion-dependent (self) UMPylation ແລະ GMPylation, ເຊິ່ງຂຶ້ນກັບສາມຖານລໍາດັບທີ່ຮັກສາໄວ້ຢູ່ໃນ nestovirus, AN, BN ແລະ CN ສ່ວນທີ່ເຫຼືອໃນລໍາດັບ.ບ່ອນທີ່ N ຫຍໍ້ມາຈາກ NiRAN) (16).N-terminal flanking ຂອງ motifs ເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນ preAN motif ອະນຸລັກຫນ້ອຍ.ບາງສ່ວນຂອງການຕົກຄ້າງເຫຼົ່ານີ້ຍັງຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ kinases ທາດໂປຼຕີນຈາກຫ່າງໄກສອກຫຼີກ, ບ່ອນທີ່ເຂົາເຈົ້າໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີສ່ວນກ່ຽວຂ້ອງກັບ nucleoside triphosphate (NTP) binding ແລະກິດຈະກໍາ catalytic (20, 21).ສອດຄ່ອງກັບການສັງເກດການນີ້, ຫຼາຍໆບ່ອນ residues ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວທີ່ສໍາຄັນໃນ pseudokinase SelO ຈາກ Pseudomonas syringae ສາມາດປະກອບກັບ supercomplex SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ທີ່ຈັດພີມມາບໍ່ດົນມານີ້.ອານຸລັກ Coronavirus NiRAN residues superimposed ໃນ microstructure ເອເລັກໂຕຣນິກ.ທາດໂປຼຕີນຈາກ Recombinant (17).ມີການຄາດເດົາວ່າ U/GMPylation ທີ່ເປັນເອກະສານ (ຕົນເອງ) ຈະຜະລິດສະຖານະຊົ່ວຄາວເພື່ອໂອນ NMP ໄປຫາຊັ້ນຍ່ອຍ (ປະຈຸບັນບໍ່ຮູ້ຈັກ) (16), ແລະຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງໂຄງສ້າງລະຫວ່າງ NiRAN ແລະທາດໂປຼຕີນ kinase (17, 19) ແມ່ນສົມມຸດຕິຖານວ່າ. NiRAN ດັດແປງໂປຣຕີນອື່ນໆ.

ລັກສະນະຫຼາຍຢ່າງ, ລວມທັງການເຊື່ອມໂຍງລະບົບທີ່ເປັນເອກະລັກແລະເປັນເອກະລັກຂອງມັນກັບເຊື້ອໄວຣັສທີ່ຕັ້ງຢູ່ໃນຮັງແລະການແຍກທາງພັນທຸກໍາຈາກ RdRp, ເຮັດໃຫ້ NiRAN ເປັນ enzyme ກົດລະບຽບທີ່ສໍາຄັນທີ່ສົມເຫດສົມຜົນສໍາລັບໄວຣັສຮັງ, ເຊິ່ງເປັນສິ່ງສໍາຄັນຕໍ່ການເກີດໃຫມ່ແລະຕົວຕົນຂອງມັນ.ກ່ອນຫນ້ານີ້, ສາມຫນ້າທີ່ທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ NiRAN ເພື່ອຄວບຄຸມການແປພາສາ genome / subgenomic ຫຼື replication / transcription ຖືກເອີ້ນວ່າ.ເມື່ອພິຈາລະນາຂໍ້ມູນທີ່ຂາດແຄນແລະບໍ່ຄົບຖ້ວນທີ່ມີຢູ່ໃນເວລາ, ແຕ່ລະຫນ້າທີ່ມີຂໍ້ດີແລະຂໍ້ເສຍຂອງມັນ (16).ໃນການຄົ້ນຄວ້ານີ້, ພວກເຮົາມີຈຸດປະສົງເພື່ອສົມທົບການສຶກສາທາງຊີວະເຄມີແລະພັນທຸກໍາປີ້ນກັບກັນຂອງໂຣກ coronaviruses ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງສອງຊະນິດ, ແລະເຮັດໃຫ້ການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາຢູ່ໃນພື້ນຖານວິວັດທະນາການຂອງການກາຍພັນທໍາມະຊາດຂອງຄອບຄົວໂຣກ coronavirus, ເພື່ອສ້າງຄວາມເຂົ້າໃຈໃນພື້ນທີ່ລຶກລັບນີ້.ພວກເຮົາລາຍງານຄວາມກ້າວຫນ້າທີ່ສໍາຄັນໃນຄວາມເຂົ້າໃຈຂອງ NiRAN ໂດຍຜ່ານການກໍານົດເປົ້າຫມາຍທໍາມະຊາດໃນ RTC, ເຊິ່ງ (ໃນບັນດາສາມສົມມຸດຕິຖານທີ່ມີຢູ່) ປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນບົດບາດຂອງໂດເມນນີ້ໃນການລິເລີ່ມການສັງເຄາະຂອງ RNA ເຊື້ອໄວຣັສທີ່ຕິດຢູ່.ການຄົ້ນຄວ້ານີ້ຍັງເປີດຄວາມເປັນໄປໄດ້ສໍາລັບບົດບາດອື່ນໆຂອງ NiRAN ໃນການໂຕ້ຕອບເຈົ້າພາບຂອງເຊື້ອໄວຣັສ.

ເພື່ອສະແດງຄຸນສົມບັດຂອງເອນໄຊຂອງເຊື້ອໄວຣັສ corona nsp12 ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ NiRAN domain, ພວກເຮົາໄດ້ຜະລິດຮູບແບບປະສົມຂອງໂຣກ coronavirus ຂອງມະນຸດ 229E (HCoV-229E) nsp12 ໃນ E. coli, ດ້ວຍແທັກ His6 ຢູ່ທີ່ປາຍ C, ແລະປະສົມປະສານ. ທາດໂປຼຕີນທີ່ມີ [α32-P] Incubate ຮ່ວມກັບ NTP ໃນທີ່ປະທັບຂອງ MnCl2 ຕາມທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນວັດສະດຸແລະວິທີການ.ການວິເຄາະຜະລິດຕະພັນຕິກິຣິຍາໄດ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການມີທາດໂປຼຕີນຈາກ radiolabelated ຮ່ວມກັນກັບ nsp12 (106 kDa), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າໂຣກ coronavirus nsp12 catalyzes ການສ້າງທາດໂປຼຕີນຈາກ covalent-NMP adducts, ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍນິຍົມກັບ uridine monophosphate (UMP) (ຮູບ 1A) ແລະ. ຂ).ການວິເຄາະດ້ານປະລິມານໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເມື່ອປຽບທຽບກັບ nucleotides ອື່ນໆ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງສັນຍານຂອງການລວມຕົວຂອງ UMP ເພີ່ມຂຶ້ນ 2 ຫາ 3 ເທົ່າ (ຮູບ 1C).ຂໍ້ມູນນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການເຄື່ອນໄຫວຂອງ NMP transferase ທີ່ຄາດຄະເນຂອງໂດເມນ NiRAN ຂອງໂຣກ coronavirus (16), ແຕ່ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມມັກ nucleotide ຂອງໂດເມນ NiRAN ຂອງໂຣກ coronavirus ແລະເຊື້ອໄວຣັສ arterial ແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ.

ການເຄື່ອນໄຫວຂອງຕົນເອງ NMPylation ຂອງ HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ຖືກ incubated ກັບ [α-32P] NTP ທີ່ກໍານົດໄວ້ໃນທີ່ປະທັບຂອງ 6 mM MnCl2 ສໍາລັບ 30 ນາທີ (ເບິ່ງວັດສະດຸແລະວິທີການສໍາລັບລາຍລະອຽດ).ຜະລິດຕະພັນປະຕິກິລິຢາໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍ SDS-PAGE ແລະ stained ກັບ Coomassie brilliant ສີຟ້າ.(B) ທາດໂປຼຕີນຈາກ radiolabeled ແມ່ນເບິ່ງເຫັນໄດ້ໂດຍການຖ່າຍຮູບຟອສຟໍ.ຕໍາແຫນ່ງຂອງ nsp12-His6 ແລະເຄື່ອງຫມາຍມະຫາຊົນໂມເລກຸນທາດໂປຼຕີນ (ໃນ kilodaltons) ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນ A ແລະ B. (C) ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງສັນຍານ radioactive (ສະເລ່ຍ ± SEM) ໄດ້ຖືກກໍານົດຈາກສາມການທົດລອງເອກະລາດ.*P≤0.05.ຄວາມແຮງຂອງສັນຍານ (ເປີເຊັນ) ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບ UTP.

ເຖິງແມ່ນວ່າກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ NiRAN ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບການຈໍາລອງ EAV ແລະ SARS-CoV ໃນວັດທະນະທໍາເຊນ (16), ຫນ້າທີ່ສະເພາະຂອງ NiRAN ແລະເປົ້າຫມາຍທີ່ມີທ່າແຮງຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຖືກກໍານົດ.ຄວາມຄ້າຍຄືກັນທາງດ້ານໂຄງສ້າງລະຫວ່າງ NiRAN ແລະຄອບຄົວຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ມີການພັບຄ້າຍຄືທາດໂປຼຕີນ (17, 22) ໄດ້ກະຕຸ້ນໃຫ້ພວກເຮົາທົດສອບສົມມຸດຕິຖານວ່າ NiRAN ກະຕຸ້ນ NMPylation ຂອງທາດໂປຼຕີນອື່ນໆ.ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງຊຸດຂອງເປົ້າຫມາຍ homologous ທີ່ມີທ່າແຮງ, ລວມທັງໂປຣຕີນທີ່ບໍ່ແມ່ນໂຄງສ້າງທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດໂດຍ HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ແຕ່ລະປະກອບດ້ວຍແທັກ C-terminal His6 (SI appendix, ຕາຕະລາງ S1), ແລະ incubate ທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ດ້ວຍ [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) ໃນການສະແດງຫຼືບໍ່ມີ nsp12.Bovine serum albumin ແລະ MBP-LacZα fusion ທາດໂປຼຕີນທີ່ຜະລິດໃນ E. coli ໄດ້ຮັບຜິດຊອບເປັນການຄວບຄຸມ (ຮູບ 2A, ເລນ 1 ຫາ 7).ທາດໂປຼຕີນຈາກ radiolabeled ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ແລະ autoradiography, ແລະພົບວ່າມີສັນຍານ radioactive ທີ່ເຂັ້ມແຂງໃນປະຕິກິລິຍາທີ່ມີ nsp12 ແລະ nsp9.ຕໍາແຫນ່ງຂອງສັນຍານກົງກັນກັບມະຫາຊົນໂມເລກຸນຂອງ nsp9, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງ nsp12-mediated UMPylation ຂອງ nsp9 (ຮູບ 2B, ຕິດຕາມ 7).ບໍ່ມີທາດໂປຼຕີນຈາກການທົດສອບອື່ນໆໄດ້ຖືກພົບເຫັນວ່າເປັນ UMPylated, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າ nsp9 ເປັນ substrate ສະເພາະຂອງ nsp12.ສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ມູນ NMPylation ດ້ວຍຕົນເອງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 1, nsp12 ສາມາດໂອນ NMP ທັງສີ່ໄປຫາ nsp9, ເຖິງແມ່ນວ່າປະສິດທິພາບຈະແຕກຕ່າງກັນ, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ( ຮູບ).3 A ແລະ B).ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ໃຊ້ໃນການວິເຄາະນີ້ (ເຮັດໃຫ້ປະຕິກິລິຢາແລະເວລາສໍາຜັດສັ້ນລົງ, ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ nsp12; ວັດສະດຸແລະວິທີການ), NMPylation ຕົນເອງຂອງ nsp12 ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ (ປຽບທຽບຮູບ 2B, ເສັ້ນ 7, ແລະຮູບ 1B), ເຊິ່ງ. ພິສູດປະສິດທິພາບ (ແລະຫຼາຍຮອບ) UMP ຍ້າຍຈາກ nsp12 ໄປ nsp9.ກິດຈະກໍາ UMP transferase ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປະກົດຕົວຂອງ Mn2+ ions, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 3C, ໃນຂະນະທີ່ພຽງແຕ່ກິດຈະກໍາ UMP transferase ຫນ້ອຍທີ່ສຸດໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນທີ່ປະທັບຂອງ Mg2+, ແລະບໍ່ມີກິດຈະກໍາໃດໆຢູ່ໃນສອງ cations divalent ອື່ນໆທີ່ທົດສອບ.ຂໍ້ມູນທີ່ຄ້າຍຄືກັນແມ່ນໄດ້ຮັບໃນການວິເຄາະ NMPylation ທີ່ປະກອບດ້ວຍ cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), ແລະ adenosine triphosphate (ATP) (SI appendix, ຮູບ S1).

HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation ຂອງ nsp9.ຊຸດຂອງໂປຣຕີນຍ່ອຍ (ລວມທັງ albumin serum bovine, MBP-lacZα, ແລະຊຸດຂອງ HCoV-229E nsps ທີ່ຕິດສະຫຼາກດ້ວຍ C-terminal His6 ທີ່ເຂົ້າລະຫັດໂດຍ ORF1a) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະເມີນກິດຈະກໍາ UMPylation ຂອງ HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated ໂປຣ​ຕີນ.Incubate ທາດໂປຼຕີນທີ່ມີ [α-32P] UTP ສໍາລັບ 10 ນາທີໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີ (A) ຫຼືມີ (B) ຂອງ nsp12 ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນອຸປະກອນການແລະວິທີການ.ຢູ່ເທິງສຸດຂອງ A ແລະ B, SDS-polyacrylamide gel stained ກັບ Coomassie Brilliant Blue ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ, ແລະຢູ່ດ້ານລຸ່ມຂອງ A ແລະ B, autoradiograms ທີ່ສອດຄ້ອງກັນແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.ຕໍາແຫນ່ງຂອງເຄື່ອງຫມາຍມະຫາຊົນໂມເລກຸນທາດໂປຼຕີນ (ເປັນກິໂລດາລຕັນ) ແມ່ນໃຫ້ຢູ່ເບື້ອງຊ້າຍ.ຕໍາແຫນ່ງຂອງ nsp12-His6 (B, ເທິງ) ແລະສັນຍານ radioactive ສັງເກດເຫັນໃນລະຫວ່າງການ incubation ຂອງ nsp12-His6 ກັບ nsp9-His6 (B, ເລນ 7) ແມ່ນຊີ້ໃຫ້ເຫັນ, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ [α-32P]UMP ກັບ nsp9-His6. (12.9 kDa), ເຊິ່ງບໍ່ໄດ້ສັງເກດເຫັນສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຈາກການທົດສອບອື່ນໆ.

HCoV-229E NiRAN-mediated biochemical and virological characterization of nsp9 NMPylation.(A ແລະ B) ບົດບາດຂອງ nucleotide co-substrate ທີ່ໃຊ້ໃນປະຕິກິລິຍາ.Nsp12-His6 ແລະ nsp9-His6 ຖືກປະສົມແລະ incubated ໃນທີ່ປະທັບຂອງ NTPs [α-32P] ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນການທົດສອບ NMPylation ມາດຕະຖານ.(A, ເທິງ) Coomassie-stained nsp9-His6 ແຍກໂດຍ SDS-PAGE.(A, ລຸ່ມ) Autoradiograph ຂອງພື້ນທີ່ດຽວກັນຂອງ gel.(B) ກິດຈະກໍາພີ່ນ້ອງ (ສະເລ່ຍ ± SEM) ໃນທີ່ປະທັບຂອງ nucleotide cofactor ກໍານົດແມ່ນກໍານົດຈາກສາມການທົດລອງເອກະລາດ.*P≤0.05.(C) ບົດບາດຂອງ ions ໂລຫະ.ສະແດງໃຫ້ເຫັນແມ່ນການທົດສອບ NMPylation ມາດຕະຖານໃນທີ່ປະທັບຂອງ [α-32P] UTP ແລະ ions ໂລຫະທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ລະຄົນມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ 1 mM.ໃນ C, ເທິງ, Coomassie stained nsp9-His6 ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ, ແລະໃນ C, ດ້ານລຸ່ມ, autoradiography ທີ່ສອດຄ້ອງກັນແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ.ຂະໜາດຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຕິດສະຫຼາກ (ເປັນກິໂລດາລຕັນ) ແມ່ນສະແດງຢູ່ທາງຊ້າຍຂອງ A ແລະ C. (D) ຮູບແບບທີ່ກາຍພັນຂອງ HCoV-229E nsp12-His6 ທີ່ບັນຈຸການທົດແທນອາຊິດ amino ທີ່ລະບຸໄວ້ຢູ່ໃນ [α-32P]UTP, ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້. ໃນວັດສະດຸແລະວິທີການ.radiolabeled nsp9-His6 ທີ່ຜະລິດໃນປະຕິກິລິຍາ NMPylation ຖືກກວດພົບໂດຍການຖ່າຍຮູບ phosphorylation (D, ເທິງ).ກິດຈະກໍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງປຽບທຽບກັບທາດໂປຼຕີນຈາກປ່າທໍາມະຊາດ (wt) ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນ D, ແລະທາງລຸ່ມແມ່ນປະຕິບັດເປັນຄ່າສະເລ່ຍ (±SEM) ຈາກສາມການທົດລອງເອກະລາດ.ເຄື່ອງໝາຍດາວບົ່ງບອກເຖິງການທົດແທນສານຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັກສາໄວ້.(E) titer ເຊື້ອໄວຣັສໃນ supernatant ວັດທະນະທໍາຂອງຈຸລັງ p1 ໄດ້ຮັບ 24 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການຕິດເຊື້ອໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍ plaque assay.ການທົດແທນ codon ໃນໂດເມນ NiRAN ຂອງຕົວປ່ຽນແປງ HCoV-229E ທີ່ຖືກວິສະວະກໍາແມ່ນຊີ້ໃຫ້ເຫັນ (ຈໍານວນ residue ແມ່ນອີງໃສ່ຕໍາແຫນ່ງຂອງພວກເຂົາໃນ pp1ab).replication-deficient RdRp active site mutant nsp12_DD4823/4AA ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມ.

ເພື່ອສ້າງຄວາມເຂົ້າໃຈຢ່າງເລິກເຊິ່ງກ່ຽວກັບສະຖານທີ່ເຄື່ອນໄຫວຂອງ NiRAN ແລະກໍານົດສານຕົກຄ້າງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບກິດຈະກໍາຂອງ nsp9-specific NMP transferase, ພວກເຮົາໄດ້ເຮັດການວິເຄາະການກາຍພັນ, ເຊິ່ງພວກເຮົາໄດ້ທົດແທນການຕົກຄ້າງແບບອະນຸລັກໃນ NiRAN AN, BN ແລະ CN motifs ( 16) ມັນແມ່ນ Ala (SI appendix, ຮູບ S2).ນອກຈາກນັ້ນ, ຜົນກະທົບຂອງການທົດແທນ Arg-to-Lys ຫຼື Lys-to-Arg ແບບອະນຸລັກໄດ້ຖືກປະເມີນໃນສອງກໍລະນີ.ໃນຖານະທີ່ເປັນການຄວບຄຸມ (ທາງລົບ), ສານຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ໄດ້ເກັບຮັກສາໄວ້ ຫຼື ໜ້ອຍກວ່າຢູ່ໃນໂດເມນ NiRAN ຂອງໄວຣັສໂຄໂຣນາ ແລະໄວຣັສທີ່ຕິດຢູ່ໃນຮັງອື່ນໆຈະຖືກແທນທີ່ດ້ວຍ Ala. ການປ່ຽນແທນ K4116A (ໃນ motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) ແລະ D4280A (CN) ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຫຼືແມ້ກະທັ້ງການລົບລ້າງ nsp9 NMPylation ຜ່ານ nsp12, ໃນຂະນະທີ່ທາດໂປຼຕີນທີ່ມີການທົດແທນແບບອະນຸລັກ (R4178K), K4116R) ຮັກສາ 60% ແລະ 80% ຂອງກິດຈະກໍາຂອງເຂົາເຈົ້າ, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການຜ່ອນຄາຍຂອງຂໍ້ຈໍາກັດໃນດ້ານຂອງເຂົາເຈົ້າ. ລະບົບຕ່ອງໂສ້ແມ່ນມີຄວາມອ່ອນໄຫວດ້ານຟີຊິກເຄມີ (ຮູບ 3D).ການທົດແທນສານຕົກຄ້າງທີ່ອະນຸລັກອື່ນໆຈໍານວນຫນຶ່ງ E4145A, D4273A, F4281A ແລະ D4283A ແມ່ນເປັນອັນຕະລາຍຫນ້ອຍຫຼາຍ, ແລະ nsp9 UMPylation ແມ່ນຫຼຸດລົງພຽງແຕ່ປານກາງ.ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນແມ່ນໄດ້ຮັບໃນ nsp9 ປະຕິກິລິຍາ NMPylation ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ NTPs ອື່ນໆ (ຮູບ 3D ແລະ SI appendix, ຮູບ S3), ຢືນຢັນວ່າຜົນກະທົບທີ່ສັງເກດເຫັນກ່ຽວກັບການທົດແທນອາຊິດ amino ສະເພາະແມ່ນເອກະລາດຂອງປະເພດຂອງ nucleotide co-substrate ທີ່ໃຊ້.ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບຜົນກະທົບທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງການທົດແທນ nsp12 ເຫຼົ່ານີ້ຕໍ່ການຈໍາລອງຂອງໂຣກ coronaviruses ໃນວັດທະນະທໍາເຊນ.ເພື່ອຈຸດນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ແມ່ແບບ DNA (cDNA) ເສີມທີ່ສ້າງດ້ວຍພັນທຸກໍາທີ່ເຫມາະສົມທີ່ໂຄນຢູ່ໃນເຊື້ອໄວຣັດວັກຊີນປະສົມ (23, 24) ເພື່ອຖ່າຍທອດ 5 -7 ຈຸລັງ.Titration ຂອງເຊື້ອໄວຣັດທີ່ຕິດເຊື້ອທີ່ຜະລິດຢູ່ໃນຈຸລັງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຕົວກາຍພັນ HCoV-229E NiRAN ສ່ວນໃຫຍ່ບໍ່ເປັນໄປໄດ້ (ຮູບ 3E).ກຸ່ມຂອງ mutants viral ທີ່ບໍ່ມີຄວາມເປັນໄປໄດ້ປະກອບມີທາງເລືອກທີ່ໄດ້ຮັບການສະແດງໃຫ້ເຫັນການລົບລ້າງຫຼືຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍກິດຈະກໍາ NMP transferase ໃນ vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ແຕ່ມີສອງທາງເລືອກອື່ນ (K4116R, E4805A) % ສະຫງວນ?ກິດຈະກໍາ NMPylation ໃນ vitro ຂອງພວກເຂົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າມີຂໍ້ຈໍາກັດເພີ່ມເຕີມ.ເຊັ່ນດຽວກັນ, ການກາຍພັນອີກສອງອັນ (R4178K, F4281A) ທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດການຫຼຸດລົງໃນລະດັບປານກາງຂອງກິດຈະກໍາ NMPylation ຂອງ NiRAN ໃນ vitro ໄດ້ຜະລິດໄວຣັສທີ່ມີຊີວິດ, ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໄວຣັສເຫຼົ່ານີ້ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ titers ໂດຍຜ່ານການຈໍາລອງ.ສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ມູນກິດຈະກໍາໃນ vitro ທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 3D, ການທົດແທນສີ່ສານຕົກຄ້າງອື່ນໆທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການຮັກສາໄວ້ຢູ່ໃນໂຣກ coronavirus ແລະ/ຫຼືເຊື້ອໄວຣັສທີ່ຕິດຢູ່ໃນຮັງອື່ນໆ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ຜະລິດເຊື້ອໄວຣັສທີ່ມີປະໂຫຍດຕໍ່ລູກຫລານ, ເຖິງແມ່ນວ່າຈະມີ titer ຫຼຸດລົງປານກາງເມື່ອທຽບກັບເຊື້ອໄວຣັສປະເພດທໍາມະຊາດ (ຮູບ 3E).

ເພື່ອສຶກສາວ່າກິດຈະກໍາ NiRAN-mediated NMP transferase ແມ່ນຂຶ້ນກັບໂດເມນ RdRp ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວຫຼືບໍ່, ສອງ residues Asp ທີ່ຖືກອະນຸລັກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການປະສານງານຂອງ divalent metal ions (11) ໃນ RdRp motif C ຖືກແທນທີ່ໂດຍ Ala. ທາດໂປຼຕີນທີ່ເປັນຜົນມາຈາກ nsp12_DD4823/4AA ຍັງຄົງຢູ່. ກິດຈະກໍາ nsp9 NMPylation ຂອງມັນ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າກິດຈະກໍາ nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation ບໍ່ຈໍາເປັນຕ້ອງມີກິດຈະກໍາ polymerase (SI Appendix, ຮູບ S4).

ຫຼັງຈາກສ້າງຕັ້ງກິດຈະກໍາ NMP transferase ສະເພາະ nsp9 ສໍາລັບ nsp12, ພວກເຮົາໄດ້ພະຍາຍາມກໍານົດລັກສະນະ NMP-nsp9 adduct ໂດຍ mass spectrometry (MS).ປະລິມານທາດໂປຼຕີນທີ່ສົມບູນຂອງ HCoV-229E nsp9 ທີ່ປະສົມກັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຈຸດສູງສຸດຢູ່ທີ່ 12,045 Da (ຮູບ 4A).ການເພີ່ມຂອງ nsp12 ບໍ່ໄດ້ປ່ຽນແປງຄຸນນະພາບຂອງ nsp9, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ nsp12 ແລະ nsp9 ຈະບໍ່ເປັນສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ຫມັ້ນຄົງພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ໃຊ້ (denaturation) (ຮູບ 4A).ໃນທີ່ປະທັບຂອງ UTP ແລະ GTP, ການວັດແທກມະຫາຊົນຂອງຕິກິຣິຍາທີ່ມີ nsp9 ແລະ nsp12 ຕາມລໍາດັບສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມະຫາຊົນທາດໂປຼຕີນຂອງ UTP ຍ້າຍ 306 Da, ແລະມະຫາຊົນທາດໂປຼຕີນຂອງ GTP ຍ້າຍ 345 Da, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແຕ່ລະໂມເລກຸນ nsp9 ຜູກມັດ UMP ຫຼື GMP. (ຮູບ 4) C ແລະ D).ມີການຄາດເດົາວ່າພະລັງງານທີ່ຕ້ອງການສໍາລັບ NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ແມ່ນມາຈາກ NTP hydrolysis ແລະການປ່ອຍ pyrophosphate.ເຖິງແມ່ນວ່າ molar ເກີນ 10 ເທົ່າຂອງ nsp9 (ເປົ້າຫມາຍ) ຫຼາຍກ່ວາ nsp12 (enzyme) ຖືກນໍາໃຊ້ໃນຕິກິຣິຍານີ້, NMPylation ເກືອບສົມບູນຂອງ nsp9 ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າປະຕິສໍາພັນລະຫວ່າງ nsp12 ແລະ nsp9 ແມ່ນສັ້ນ, ແລະ nsp12 ສາມາດ NMPylate ຫຼາຍ nsp9. ໂມເລກຸນໃນ vitro.

NMPylation ດຽວຂອງ nsp9 ໃນທີ່ປະທັບຂອງ nsp12 ແລະ UTP ຫຼື GTP.ສະແດງໃຫ້ເຫັນເປັນກຸ່ມທາດໂປຼຕີນທີ່ສົມບູນແບບ deconvoluted ຂອງ HCoV-229E nsp9 (SI appendix, ຕາຕະລາງ S1) (AD).(A) nsp9 ດຽວ, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 ໃນທີ່ປະທັບຂອງ UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ໃນທີ່ປະທັບຂອງ GTP.

ເພື່ອກໍານົດການຕົກຄ້າງ nsp9 UMPylated ໂດຍ nsp12, nsp9-UMP ຖືກຂັດດ້ວຍ trypsin.peptides ຜົນໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍ nano-high performance liquid chromatography (HPLC) ແລະວິເຄາະໂດຍ tandem mass spectrometry (MS/MS) ອອນໄລນ໌.ການວິເຄາະຂໍ້ມູນໂດຍໃຊ້ຊຸດຊອບແວ Byonic (Protein Metrics) ສະແດງໃຫ້ເຫັນ UMPylation ຂອງອາຊິດ amino N-terminal.ອັນນີ້ຖືກຢືນຢັນດ້ວຍຕົນເອງ.ຂອບເຂດມະຫາຊົນ tandem ຂອງ precursor peptide [UMP]NNEIMPGK (SI appendix, Figure S5A) ເປີດເຜີຍຊິ້ນສ່ວນຢູ່ທີ່ 421 m/z, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ UMP ຜູກມັດກັບ residue 1 ຂອງ nsp9.

ຢູ່ທີ່ N-terminus ຂອງ nsp9, Asn ໄດ້ຖືກອະນຸລັກໃນບັນດາສະມາຊິກຂອງ Orthocoronavirinae (SI appendix, ຮູບ S6).ເຖິງແມ່ນວ່າພວກເຮົາເຊື່ອວ່າ N-terminal amine ໄນໂຕຣເຈນຕົ້ນຕໍແມ່ນເປັນທີ່ຍອມຮັບຫຼາຍທີ່ສຸດສໍາລັບ UMP, ພວກເຮົາຕັດສິນໃຈທີ່ຈະໄດ້ຮັບຫຼັກຖານເພີ່ມເຕີມຂອງການຜູກມັດ NMP ຢູ່ N-terminal.ສໍາລັບເຫດຜົນນີ້, peptide ທີ່ບໍ່ແມ່ນ NMPylated ແລະ NMPylated N-terminal peptide nsp9 ບໍລິສຸດໂດຍ HPLC ໄດ້ມາຈາກການມີ acetone ແລະ sodium cyanoborohydride.ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂເຫຼົ່ານີ້, ພຽງແຕ່ amines ປະຖົມຟຣີສາມາດຖືກດັດແປງດ້ວຍ propyl (25).peptide N-terminal nsp9-derived ກັບລໍາດັບ NNEIMPGK ມີສອງ amines ຕົ້ນຕໍ, ອັນຫນຶ່ງຢູ່ທີ່ N-terminus ຂອງ Asn ແລະອີກອັນຫນຶ່ງຢູ່ໃນຕ່ອງໂສ້ຂ້າງຂອງ Lys ຢູ່ C-terminus.ດັ່ງນັ້ນ, ກຸ່ມ propyl ສາມາດຖືກນໍາສະເຫນີຢູ່ທັງສອງສົ້ນ.chromatograms ion ສະກັດຂອງ peptides ທີ່ບໍ່ແມ່ນ NMPylated ແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ SI, ຮູບ S5B.ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, N-terminal ແລະ C-terminal (mono)propylated (SI appendix, Figure S5B, upper lane) ແລະ dipropylated peptides (SI appendix, Figure S5B, lower lane) ສາມາດລະບຸໄດ້.ຮູບແບບນີ້ປ່ຽນແປງດ້ວຍການໃຊ້ NMPylated N-terminal peptide ຂອງ nsp9.ໃນກໍລະນີນີ້, ພຽງແຕ່ C-terminal propylated peptides ສາມາດຖືກກໍານົດ, ແຕ່ N-terminal propylated peptides ແລະ dipropylated peptides ບໍ່ໄດ້ຖືກລະບຸ (SI Appendix, Figure S5C), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ UMP ໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາ N-terminal primary amine ເພື່ອປ້ອງກັນການນີ້. ກຸ່ມຈາກການປ່ຽນແປງ.

ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາປ່ຽນແທນ (ດ້ວຍ Ala ຫຼື Ser) ຫຼືລຶບສານຕົກຄ້າງທີ່ສະຫງວນໄວ້ຢູ່ທີ່ N-terminus ຂອງ nsp9 ເພື່ອກໍານົດຂໍ້ຈໍາກັດສະເພາະເປົ້າຫມາຍ.ອີງຕາມຂໍ້ມູນ MS ຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ NiRAN ປະກອບເປັນ adduct nsp9-NMP ກັບ amine ຕົ້ນຕໍຂອງ N-terminal residue ຂອງ nsp9, ພວກເຮົາສົມມຸດວ່າ nsp9 NMPylation ຕ້ອງການ protease ຕົ້ນສະບັບຂອງໄວຣັດ (Mpro, nsp5) ເພື່ອປ່ອຍ Nsp9 N-terminal ຈາກ ທາດໂປຼຕີນຈາກທາດໂປຼຕີນຂອງມັນ.ເພື່ອທົດສອບສົມມຸດຕິຖານນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຜະລິດທາດໂປຼຕີນ precursor nsp7-11 ທີ່ມີ nsp9 ໃນ E. coli ແລະເຮັດການທົດສອບມາດຕະຖານ NMPylation ໃນທີ່ປະທັບຂອງ [α-32P] UTP (ວັດສະດຸແລະວິທີການ).ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 5A (ເລນ 3), ຄາຣະວາ nsp7-11 ທີ່ບໍ່ຖືກຕັດບໍ່ຖືກວິທະຍຸດ້ວຍ nsp12.ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຖ້າ nsp7-11 ຖືກແຍກໂດຍ nsp5 recombinant ເພື່ອປ່ອຍ nsp9 (ແລະ nsps ອື່ນໆ) ອອກຈາກຄາຣະວາ, ທາດໂປຼຕີນຈາກ radiolabeled ທີ່ເຄື່ອນຍ້າຍກັບ nsp9 ໄດ້ຖືກກວດພົບ, ຢືນຢັນການສະຫລຸບຂອງພວກເຮົາວ່າ NiRAN ແລະ N- ການຄັດເລືອກຂອງ adducts covalent nsp9-NMP. .amine ຕົ້ນຕໍຢູ່ປາຍຍອດຂອງ N-terminal Asn (ຕໍາແໜ່ງ 3825 ໃນ pp1a/pp1ab).ການສະຫລຸບນີ້ຍັງໄດ້ຮັບການສະຫນັບສະຫນູນໂດຍການທົດລອງໂດຍໃຊ້ nsp9 construct, ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍຫນຶ່ງຫຼືສອງ residues ເພີ່ມເຕີມຢູ່ທີ່ N-terminus.ໃນທັງສອງກໍລະນີ, NiRAN-mediated UMPylation ຂອງ nsp9 ໄດ້ຖືກຍົກເລີກ (SI Appendix, ຮູບ S7).ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາຜະລິດທາດໂປຼຕີນທີ່ມີຫນຶ່ງຫຼືສອງ residue Asn ທີ່ຖືກລົບອອກຈາກລໍາດັບ peptide 3825-NNEIMPK-3832 ທີ່ N-terminal ຂອງ nsp9.ໃນທັງສອງກໍລະນີ, nsp9 UMPylation ໄດ້ຖືກສະກັດຢ່າງສົມບູນ (ຮູບ 5B), ສະຫນອງຫຼັກຖານເພີ່ມເຕີມວ່າ nsp9 N-terminus ທີ່ແທ້ຈິງເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນ receptor NMP.

ການປະມວນຜົນ proteolytic ຂອງ nsp9 ແລະບົດບາດຂອງ N-terminal residues ໃນ Nsp12-mediated UMPylation.(A) nsp9 UMPylation ຕ້ອງການ nsp9 N-terminal ຟຣີ.Nsp7-11-His6 ຖືກອົບລ່ວງໜ້າຢູ່ທີ່ 30 °C ໃນ buffer ການກວດຫາ NMPylation ທີ່ມີ UTP ຢູ່ຂ້າງໜ້າ ຫຼືບໍ່ມີ Mpro (nsp5-His6).ຫຼັງຈາກ 3 ຊົ່ວໂມງ, ເລີ່ມຕົ້ນການວິເຄາະ NMPylation ໂດຍການເພີ່ມ nsp12-His6 ຕາມທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນວັດສະດຸແລະວິທີການ.ປະຕິກິລິຍາທີ່ມີ nsp5-His6 (ເລນ 1) ແລະ nsp9-His6 (ເລນ 2) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມ.ຫຼັງຈາກ 10 ນາທີ, ປະຕິກິລິຢາໄດ້ສິ້ນສຸດລົງແລະປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍ SDS-PAGE.ທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກ stained ດ້ວຍ Coomassie Brilliant Blue (A, ເທິງ).ຄາຣະວາຂອງ Nsp7-11-His6 ແລະຜະລິດຕະພັນປຸງແຕ່ງທີ່ເປັນຜົນມາຈາກການແຍກຕົວກາງຂອງ nsp5-His6 ແມ່ນສະແດງຢູ່ເບື້ອງຂວາ.ກະລຸນາສັງເກດ (ເນື່ອງຈາກຂະຫນາດນ້ອຍຂອງພວກມັນ) ວ່າ nsp7 ແລະ nsp11-His6 ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ໃນ gel ນີ້, ແລະປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກເສີມດ້ວຍ nsp5-His6 (ເສັ້ນທາງ 1 ແລະ 4; ຕໍາແຫນ່ງຂອງ nsp5-His6 ແມ່ນຊີ້ໃຫ້ເຫັນໂດຍວົງກົມແຂງ) ຫຼື nsp9-His6 (Lane 2) ມີຈໍານວນ MBP ເລັກນ້ອຍ (ສະແດງໂດຍວົງເປີດ) ເປັນ impurities ຕົກຄ້າງເພາະວ່າພວກມັນສະແດງອອກເປັນ MBP fusion proteins (SI appendix, ຕາຕະລາງ S1).(B) ຕົວແປ Nsp9-His6 ຂາດໜຶ່ງ ຫຼືສອງ N-terminal Asn residues (ການໃສ່ຕົວເລກຕາມຕໍາແໜ່ງໃນ pp1a/pp1ab) ແລະຖືກເຮັດໃຫ້ບໍລິສຸດ ແລະ incubated ດ້ວຍ nsp12-His6 ແລະ [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE stained ກັບ Coomassie ແມ່ນສະແດງຢູ່ດ້ານເທິງ, B, autoradiograph ທີ່ສອດຄ້ອງກັນແມ່ນສະແດງຢູ່ດ້ານລຸ່ມ.ຕຳແໜ່ງຂອງເຄື່ອງໝາຍນ້ຳໜັກໂມເລກຸນ (ເປັນກິໂລກຣາມ) ແມ່ນສະແດງຢູ່ເບື້ອງຊ້າຍ.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal conserved residues ຖືກແທນທີ່ດ້ວຍ Ala ຫຼື Ser, ແລະປະລິມານດຽວກັນຂອງທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນປະຕິກິລິຍາ UMPylation mediated nsp12-His6.ຜະລິດຕະພັນປະຕິກິລິຢາຖືກແຍກອອກໂດຍ SDS-PAGE ແລະມີຮອຍເປື້ອນດ້ວຍ Coomassie Brilliant Blue (C, ເທິງ), ແລະ radiolabeled nsp9-His6 ຖືກກວດພົບໂດຍການຖ່າຍຮູບ phosphorescence (C, ກາງ).ການນໍາໃຊ້ທາດໂປຼຕີນຈາກປ່າທໍາມະຊາດ (wt) ເປັນການອ້າງອິງ (ກໍານົດເປັນ 100%), ກິດຈະກໍາ NMPylation ພີ່ນ້ອງ (ຫມາຍຄວາມວ່າ ± SEM) ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ຈາກສາມການທົດລອງເອກະລາດ.(D) ເຊື້ອໄວຣັສ titers ໃນ p1 cell culture supernatant ຂອງ Huh-7 cells ທີ່ຕິດເຊື້ອ HCoV-229E ປະເພດ wild-type Huh-7 cells, ແລະ mutants ທີ່ບັນຈຸການທົດແທນອາຊິດ amino ທີ່ກຳນົດໄວ້ໃນ nsp9 ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍ plaque assay.replication-deficient RdRp motif C double mutant DD4823/4AA ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມທາງລົບ.

N-terminus ຂອງ nsp9 (ໂດຍສະເພາະຕໍາແຫນ່ງ 1, 2, 3, ແລະ 6) ໄດ້ຖືກອະນຸລັກຫຼາຍໃນບັນດາສະມາຊິກຂອງຄອບຄົວຍ່ອຍ Orthocoronavirinae (SI appendix, ຮູບ S6).ເພື່ອສຶກສາບົດບາດທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງສານຕົກຄ້າງເຫຼົ່ານີ້ໃນ nsp12-mediated nsp9 NMPylation, ສອງ residue Asn ຕິດຕໍ່ກັນຢູ່ທີ່ N-terminus ຂອງ nsp9 ຖືກແທນທີ່ດ້ວຍ Ala ຫຼື Ser (ຢ່າງດຽວຫຼືປະສົມປະສານ).ເມື່ອປຽບທຽບກັບ nsp9 ປະເພດທໍາມະຊາດ, ການທົດແທນ N3825 ດ້ວຍ Ala ຫຼື Ser ເຮັດໃຫ້ມີການຫຼຸດລົງຫຼາຍກ່ວາສອງເທົ່າຂອງ UMPylation nsp12-mediated (ຮູບ 5C).ສອດຄ່ອງກັບການສະຫລຸບຂອງພວກເຮົາວ່າ NMPylation ເກີດຂື້ນຢູ່ທີ່ N-terminal primary amine ແທນທີ່ຈະເປັນຕ່ອງໂສ້ຂ້າງຄຽງຂອງ N-terminal residue, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນ NMPylation ທີ່ຕົກຄ້າງທີ່ສໍາຄັນດ້ວຍການທົດແທນ N3825A ແລະ N3825S.ຫນ້າສົນໃຈ, ຖ້າ Asn ທີສອງຖືກແທນທີ່ໂດຍ Ala ຫຼື Ser, nsp9 UMPylation ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຫຼາຍກວ່າ 10 ເທື່ອ), ໃນຂະນະທີ່ການທົດແທນຂອງ Ala ໃນຕໍາແຫນ່ງ 3, 4, ແລະ 6 ມີຜົນກະທົບປານກາງຕໍ່ nsp9 UMPylation (ຮູບ 2. ).5C).ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ ATP, CTP ຫຼື GTP (SI appendix, ຮູບ S8).ໂດຍລວມແລ້ວ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງບົດບາດສໍາຄັນຂອງ N2826 (ຕໍາແຫນ່ງ 2 ໃນ nsp9) ໃນ nsp9 NMPylation.

ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮັບຫຼັກຖານເພີ່ມເຕີມຂອງການພົວພັນທີ່ເປັນປະໂຫຍດລະຫວ່າງ N-terminus ຂອງ nsp9 ແລະ NMPylation, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການຈັດລໍາດັບຫຼາຍລໍາດັບ (MSA) ຂອງລໍາດັບ nsp9 ຂອງຄອບຄົວ Coronavirus (ແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງ 104 ແລະ 113 ຕົກຄ້າງ) (SI ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ, ຮູບ. S6).ໃນຈໍານວນທັງຫມົດ, ໃນ 47 ຊະນິດ (ທີ່ຮູ້ຈັກແລະ putative) ຂອງ 5 genera ຂອງ subfamily Orthocoronavirinae ທີ່ຕິດເຊື້ອສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ນົກ, ແລະສັດເລືອຄານ, ມີພຽງແຕ່ 8 ຕົກຄ້າງໃນຈໍານວນທັງຫມົດແມ່ນ invariant.ການປ່ຽນແປງທີ່ກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດ, ລວມທັງການລຶບແລະການໃສ່, ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນຮອບວຽນລະຫວ່າງອົງປະກອບໂຄງສ້າງຮອງຂອງ nsp9, ຕາມການກໍານົດໂດຍການສຶກສາໂຄງສ້າງທີ່ຜ່ານມາ (26 ??28).ຫ້າສານຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ປ່ຽນແປງໄດ້ຖືກພົບເຫັນຢູ່ໃນສາຍ β ແລະ α helix ຂອງສ່ວນ C-terminal ຂອງ nsp9.ສາມສິ່ງຕົກຄ້າງທີ່ບໍ່ປ່ຽນແປງປະກອບເປັນ motif NNE ຂອງ N terminus ຂອງ nsp9.ມັນໄດ້ຖືກເປີດເຜີຍວ່າ Asn ທີສອງຂອງ motif ນີ້ແມ່ນພຽງແຕ່ residue invariant, ເຊິ່ງຍັງຖືກແບ່ງປັນໂດຍສົມມຸດຕິຖານ nsp9 ຂອງໂຣກ coronavirus ກົບທີ່ຫ່າງໄກ, ແລະເປັນຕົວແທນຂອງ Microhyla letovirus 1 ຊະນິດໃນ subfamily Letovirinae ຂອງ Alphaletovirus.ການອະນຸລັກສິ່ງເສດເຫຼືອໃນອົງປະກອບໂຄງສ້າງຮອງ nsp9 ສາມາດຖືກສົມເຫດສົມຜົນໂດຍການພິຈາລະນາໂຄງສ້າງເພື່ອຮັກສາການພັບຫຼືຄຸນສົມບັດການຜູກມັດ RNA ທີ່ຮູ້ຈັກ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເຫດຜົນນີ້ເບິ່ງຄືວ່າບໍ່ໄດ້ນໍາໃຊ້ກັບການອະນຸລັກ NNE, ແລະກ່ອນການສຶກສານີ້, ລັກສະນະຂອງຂໍ້ຈໍາກັດທີ່ຈໍາກັດການປ່ຽນແປງຂອງລໍາດັບ tripeptide ໄດ້ຖືກປິດບັງຢ່າງສົມບູນ.

ເພື່ອກໍານົດຄວາມສໍາຄັນຂອງ nsp9-NMPylation ແລະການອະນຸລັກ NNE ໃນການຈໍາລອງໂຣກ coronavirus, ພວກເຮົາໄດ້ຜະລິດຕົວກາຍພັນ HCoV-229E, ເຊິ່ງປະຕິບັດການທົດແທນດຽວຫຼືສອງເທົ່າຂອງ residues nsp9 N-terminal, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ nsp9 NMPylation ເປັນອັນຕະລາຍໃນ vitro.ກ່ອນທີ່ພວກເຮົາຈະເລີ່ມຕົ້ນ, ພວກເຮົາພະຍາຍາມຕອບຄໍາຖາມບໍ່ວ່າຈະເປັນການທົດແທນເຫຼົ່ານີ້ (ຢູ່ໃກ້ກັບສະຖານທີ່ cleavage nsp8|9) ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການປຸງແຕ່ງ proteolytic ຂອງພາກພື້ນ pp1a C-terminal.ຊຸດຂອງໂຄງສ້າງໂພລີໂປຣຕີນ nsp7-11 ທີ່ມີການທົດແທນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຢູ່ທີ່ N-terminus ຂອງ nsp9 ໄດ້ຖືກຜະລິດຢູ່ໃນ E. coli ແລະຕັດດ້ວຍ Mpro ທີ່ປະສົມກັນ.ການແຕກແຍກທາດໂປຼຕີນຂອງສີ່ສະຖານທີ່ (ລວມທັງສະຖານທີ່ nsp9 flanking) ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໂດຍການທົດແທນທີ່ແນະນໍາໃດໆ (SI appendix, ຮູບ S9), ຍົກເວັ້ນການປ່ຽນແປງໂຄງສ້າງຂອງທາດໂປຼຕີນເຫຼົ່ານີ້ທີ່ແຊກແຊງກັບ cleavage Mpro-mediated nsp8|9 (ຫຼືອື່ນໆ) ເວັບໄຊທ໌.

ຈຸລັງ Huh-7 ຖືກຖ່າຍທອດດ້ວຍ genome-length HCoV-229E RNA, ການເຂົ້າລະຫັດ Ala ຫຼື Ser substitutions ໃນ NNE tripeptides ທີ່ຖືກອະນຸລັກ (N3825, N3826, ແລະ E3827) ຢູ່ທີ່ nsp9 N terminus, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການກາຍພັນສ່ວນໃຫຍ່ຕາຍແລ້ວ.ພວກເຮົາສາມາດກູ້ໄວຣັສໂດຍການປ່ຽນແທນ Ser ຫຼື Ala ຂອງ N-terminal Asn (N2835A ຫຼື N2835S), ແຕ່ບໍ່ສາມາດຟື້ນຕົວເຊື້ອໄວຣັສດ້ວຍການກາຍພັນແບບດຽວ ແລະສອງເທົ່າອື່ນໆໃນລໍາດັບ NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (ຮູບ 5D).

ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການຈໍາລອງຂອງໂຣກ coronaviruses ໃນວັດທະນະທໍາເນື້ອເຍື່ອແມ່ນຖືກຈໍາກັດ (ຄືກັນຫຼືຄ້າຍຄືກັນ), ຈໍາກັດການກາຍພັນທໍາມະຊາດຂອງສະຖານທີ່ NMPylation nsp9 ໃນຮ່າງກາຍ, ແລະສະຫນັບສະຫນູນບົດບາດສໍາຄັນຂອງການຕອບສະຫນອງນີ້ໃນວົງຈອນຊີວິດຂອງໂຣກ coronaviruses.

ໃນຊຸດສຸດທ້າຍຂອງການທົດລອງ, ພວກເຮົາໄດ້ຜະລິດ C-terminal His6 ທີ່ມີປ້າຍຊື່ SARS-CoV-2 nsp12 ແລະ nsp9, ແລະສອງຮູບແບບ mutant ຂອງ nsp12 ໃນ E. coli.ທີ່ຢູ່ residues ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວຢູ່ໃນໂດເມນ NiRAN ແລະ RdRp ຕາມລໍາດັບແມ່ນໃຊ້ Ala ແທນ (ຮູບ 6A ແລະ SI appendix, ຕາຕະລາງ S2).K4465 ໃນ SARS-CoV-2 nsp12 ກົງກັບ K4135 ໃນ HCoV-229E (SI Appendix, Figure S2), ເຊິ່ງພິສູດວ່າຕ້ອງການສໍາລັບກິດຈະກໍາ NiRAN ແລະການຈໍາລອງ HCoV-229E (ຮູບ 3D ແລະ E).ສານຕົກຄ້າງນີ້ຍັງສອດຄ່ອງກັບເຊື້ອໄວຣັດເສັ້ນເລືອດແດງ EAV nsp9 K94 residue, ເຊິ່ງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນກ່ອນຫນ້ານີ້ວ່າມີຄວາມຈໍາເປັນສໍາລັບ NiRAN self-UMPylation / self-GMPylation (16).ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບ 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ມີການເຄື່ອນໄຫວ UMP transferase ໂດຍໃຊ້ nsp9 ເປັນ substrate, ໃນຂະນະທີ່ nsp12_K4465A active site mutant ບໍ່ເຄື່ອນໄຫວ.ການທົດແທນສອງເທົ່າໃນລໍາດັບລັກສະນະ SDD ຂອງ RdRp motif C ບໍ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ກິດຈະກໍາ UMP transferase (ຮູບ 6B), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າກິດຈະກໍາ RdRp ບໍ່ມີຜົນກະທົບໂດຍກົງໃນ nsp9 UMPylation.ຂໍ້ມູນທີ່ຄ້າຍຄືກັນແມ່ນໄດ້ຮັບໂດຍໃຊ້ CTP, GTP ແລະ ATP (SI appendix, ຮູບ S10).ສະຫຼຸບສັງລວມ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ມີກິດຈະກໍາອະນຸລັກຢູ່ໃນໂຣກ coronaviruses ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງຊະນິດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ subfamily orthocoronavirus.

SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation ຂອງ nsp9.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel ສະແດງໃຫ້ເຫັນທາດໂປຼຕີນຈາກ recombinant ທີ່ໃຊ້ໃນການທົດສອບ NMPylation.ໃນຖານະເປັນການຄວບຄຸມ, ທາດໂປຼຕີນຈາກ mutant ທີ່ມີການທົດແທນສະຖານທີ່ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວຢູ່ໃນໂດເມນ NiRAN (K4465A) ແລະ RdRp domain (DD5152/3AA) ຂອງ SARS-CoV-2 nsp12 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້.ໝາຍເລກ residue ແມ່ນອີງໃສ່ຕຳແໜ່ງໃນ pp1ab.(B) Autoradiograph ຂອງການກວດຫາ UMPylation ໂດຍໃຊ້ nsp9-His6 ແລະ [α-32P]UTP ເປັນ substrate ຂອງ nsp12-His6 (ປະເພດປ່າ [wt] ແລະ mutant).ມະຫາຊົນໂມເລກຸນ (ເປັນກິໂລກຣາມ) ຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຕິດສະຫຼາກແມ່ນສະແດງຢູ່ເບື້ອງຊ້າຍ.

ໂດເມນ NiRAN ໂດຍທົ່ວໄປຖືກຮັກສາໄວ້ຢູ່ໃນ Nidovirales (16), ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າພວກມັນກະຕຸ້ນປະຕິກິລິຍາ enzymatic ທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການຈໍາລອງ Nidovirus.ໃນການສຶກສານີ້, ພວກເຮົາສາມາດພິສູດໄດ້ວ່າໂດເມນ NiRAN ຂອງໂຣກ coronavirus ໂອນ NMP (ຜະລິດຈາກ NTP) ໄປ nsp9, ທາດໂປຼຕີນທີ່ຜູກມັດ RNA ທີ່ລຶກລັບທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສ (26 ?? 29), ເພື່ອກໍານົດວ່າມັນເປັນເປົ້າຫມາຍທໍາມະຊາດແລະ. ຄູ່ຮ່ວມງານຂອງໂຣກ coronavirus RTC.

ໂດເມນ NiRAN ແບ່ງປັນສາມ motifs ລໍາດັບ (AN, BN, ແລະ CN), ເຊິ່ງມີຈໍານວນຂະຫນາດນ້ອຍຫຼາຍຂອງ residues ທີ່ຖືກອະນຸລັກໃນຄອບຄົວທັງຫມົດໃນຄໍາສັ່ງ Nidovirales monophyletic ແຕ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍ (8, 16).ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າພວກມັນມີຄວາມກ່ຽວຂ້ອງກັບໂຄງສ້າງຂອງຄອບຄົວທີ່ບໍ່ມີຄຸນລັກສະນະຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ kinase ທີ່ມີລັກສະນະຄ້າຍຄືກັນ, ເຊິ່ງໃນເບື້ອງຕົ້ນເອີ້ນວ່າຄອບຄົວ SelO (17, 19, 22, 30, 31).ທາດໂປຼຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ SelO ມີ kinase folds, ແຕ່ຂາດການເກັບຮັກສາໄວ້ຫຼາຍ residues ການເຄື່ອນໄຫວຢູ່ໃນ kinases ຄລາສສິກ (22, 32).ອີງໃສ່ການປະຖົມນິເທດຂອງໂມເລກຸນ ATP ທີ່ຖືກຜູກມັດກັບສະຖານທີ່ທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວແລະສະຖຽນລະພາບໂດຍການໂຕ້ຕອບສະເພາະ, SelO ໄດ້ຖືກສົມມຸດຕິຖານແລະຕໍ່ມາໄດ້ຮັບການຢືນຢັນທີ່ຈະໂອນ AMP (ແທນຟອສເຟດ) ໄປສູ່ຊັ້ນຍ່ອຍຂອງທາດໂປຼຕີນ (22), ໃນຂະນະທີ່ທາດໂປຼຕີນຈາກເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ SelO ຄ້າຍຄື YdiU ມີ. ບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການກະຕຸ້ນການຍຶດຕິດ covalent ຂອງ UMP ກັບ Tyr ແລະການຕົກຄ້າງຂອງລາວຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (33).

ເພື່ອຢືນຢັນແລະຂະຫຍາຍການຄາດຄະເນການຕົກຄ້າງຂອງສະຖານທີ່ທີ່ຫ້າວຫັນຂອງໂດເມນ NiRAN ໄວຣັສໂຄໂຣນາ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ວິທີທາງຊີວະເຄມີແລະພັນທຸກໍາຍ້ອນກັບເພື່ອປະຕິບັດການວິເຄາະການກາຍພັນຂອງໂຣກ coronavirus nsp12 (ຮູບ 3D ແລະ E ແລະ SI appendix, ຮູບ S3 ແລະຕາຕະລາງ) S1â S4).ຂໍ້ມູນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການທົດແທນຂອງ HCoV-229E K4135, R4178 ແລະ D4280 ກັບ Ala ລົບລ້າງກິດຈະກໍາ NMP transferase ໃນ vitro ແລະການຈໍາລອງຂອງເຊື້ອໄວຣັສໃນວັດທະນະທໍາເຊນ (ຮູບ 3D ແລະ E ແລະ SI appendices, ຮູບ S3), ສະຫນັບສະຫນູນການປະກົດຕົວຂອງພວກເຂົາໃນ NTP γ-phosphate. (K4135, R4178) ແລະການປະສານງານຂອງ ions ໂລຫະທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວ (D4280).ການທົດແທນ E4145A ຂອງ Glu ທີ່ຖືກອະນຸລັກຢູ່ໃນຂອບເຂດຂອງເຊື້ອໄວຣັສຮັງນົກທີ່ຄາດຄະເນວ່າຈະສະຖຽນລະພາບຕໍາແຫນ່ງ K4135 (17) ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນເພື່ອກໍາຈັດການຈໍາລອງຂອງເຊື້ອໄວຣັສ, ແຕ່ຫນ້າປະຫລາດໃຈ, ກິດຈະກໍາໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ in vitro NMPylation assay (ຮູບ 3D ແລະ E ແລະ. ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ SI, ຮູບ S3 ແລະຕາຕະລາງ S1–S4).ການສັງເກດການທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ເກີດຂຶ້ນໃນເວລາທີ່ການທົດແທນທີ່ສອດຄ້ອງກັນໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີໃນ homolog YdiU ຂອງ Salmonella typhimurium (E130A) (33).ຮ່ວມກັນ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ສະຫນັບສະຫນູນການທໍາງານຂອງລະບຽບການຂອງ residue ອະນຸລັກນີ້ແທນທີ່ຈະເປັນຫນ້າທີ່ catalytic.

ການທົດແທນການເກັບຮັກສາ Phe residue (F4281A) ພາຍໃນຂອບເຂດຂອງ nestovirus ໃນໂດເມນ HCoV-229E NiRAN (8) ເຮັດໃຫ້ເກີດການຫຼຸດລົງຂອງກິດຈະກໍາ NMPylation ໃນ vitro ແລະການຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສໃນວັດທະນະທໍາເຊນ (ຮູບ 3D, E ແລະ SI) ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ, ຮູບ S3).ຂໍ້ມູນແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຫນ້າທີ່ກົດລະບຽບທີ່ສໍາຄັນຂອງສານຕົກຄ້າງນີ້, ເຊັ່ນ: residue DFG motif Phe ທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນກ່ອນຫນ້ານີ້.ໃນ kinases ທາດໂປຼຕີນຈາກຄລາສສິກ, ມັນແມ່ນສ່ວນຫນຶ່ງຂອງການຜູກມັດ Mg2+ ແລະຊ່ວຍໃນການລວບລວມແລະຄວບຄຸມກະດູກສັນຫຼັງ???ຕ້ອງການສໍາລັບກິດຈະກໍາ catalytic ປະສິດທິພາບ (32, 34).ການທົດແທນ Ala ແລະ Arg ສໍາລັບ K4116 residue (ໃນ preAN motif), ຕາມລໍາດັບ, ລົບລ້າງການຈໍາລອງຂອງເຊື້ອໄວຣັສແລະ, ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, ມີຜົນກະທົບທີ່ແຕກຕ່າງກັນກ່ຽວກັບກິດຈະກໍາ NMP transferase ໃນ vitro, ຂຶ້ນກັບລະບົບຕ່ອງໂສ້ຂ້າງອາຊິດ amino ທີ່ນໍາສະເຫນີ (ຮູບ 3D ແລະ E ແລະ SI appendices. , ຮູບ S3).ຂໍ້ມູນທີ່ເປັນປະໂຫຍດແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ມູນໂຄງສ້າງ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າສານຕົກຄ້າງນີ້ໄດ້ສ້າງຕັ້ງປະຕິສໍາພັນກັບ ATP phosphate (17).ໃນໂດເມນ NiRAN ຂອງຄອບຄົວໄວຣັສທີ່ຕັ້ງຮັງອື່ນໆ, ຕໍາແຫນ່ງຂອງ HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ຖືກຄອບຄອງໂດຍ Lys, Arg ຫຼື His (8), ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຂໍ້ຈໍາກັດທີ່ເປັນປະໂຫຍດຂອງສານຕົກຄ້າງສະເພາະນີ້ໄດ້ຮັບການຜ່ອນຄາຍ.ການທົດແທນຂອງ D4188A ແລະ D4283A ລົບລ້າງຫຼືຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊແລະລົບລ້າງການຈໍາລອງຂອງເຊື້ອໄວຣັສ (ຮູບ 3).ທັງສອງສານຕົກຄ້າງນີ້ຖືກຮັກສາໄວ້ຢູ່ໃນໄວຣັສທີ່ຕັ້ງຮັງເປັນສ່ວນໃຫຍ່ (8), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການທໍາງານຂອງຄອບຄົວທີ່ມີຄວາມສໍາຄັນສະເພາະແຕ່ອາດບໍ່ແມ່ນທາດເລັ່ງລັດ.ການທົດແທນ Ala ຂອງສານຕົກຄ້າງ Lys ແລະ Asp ອື່ນໆຈຳນວນໜຶ່ງ (K4113A, D4180A, D4197A ແລະ D4273A) ທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການອະນຸລັກຢູ່ໃນຄອບຄົວ Coronaviridae ຫຼື Nestioviridae ອື່ນໆ (8) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນການຄວບຄຸມ.ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, ການທົດແທນເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນມີຄວາມທົນທານເປັນສ່ວນໃຫຍ່, ມີການຫຼຸດລົງເລັກນ້ອຍຂອງກິດຈະກໍາ enzyme ແລະການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສໃນບາງກໍລະນີ (ຮູບ 3 ແລະເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ SI, ຮູບ S3).ໂດຍລວມແລ້ວ, ຂໍ້ມູນການ mutagenesis ຂອງໂຣກ coronavirus ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບ GMP ຕົນເອງແລະຂໍ້ມູນພັນທຸກໍາປີ້ນກັບກັນຂອງ EAV NiRAN-RdRp (16), ເຊິ່ງ EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residue K94 (ກົງກັບ HCoV- 229E K4135) ຫນ້າທີ່ທີ່ສໍາຄັນ), R124 (ກົງກັບ R4178), D132 (ກົງກັບ D4188), D165 (ກົງກັບ D4280), F166 (ກົງກັບ F4281).ນອກຈາກນັ້ນ, ຂໍ້ມູນການ mutagenesis HCoV-229E ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບແລະຂະຫຍາຍຈາກຂໍ້ມູນພັນທຸກໍາປີ້ນກັບ SARS-CoV ທີ່ໄດ້ລາຍງານຜ່ານມາ (16), ຄືກັນກັບທີ່ສັງເກດເຫັນສໍາລັບ CN motif ທີ່ສອດຄ້ອງກັນ Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype ອະທິບາຍ -F219A ແລະ HCoV-229E_F4281A (ຮູບ 3 D ແລະ E ແລະ SI appendix, ຮູບ S3 ແລະຕາຕະລາງ S1-S4).

ເມື່ອປຽບທຽບກັບ EAV orthologs (16), ທີ່ມີຄວາມມັກທີ່ຊັດເຈນສໍາລັບ UTP ແລະ GTP (ໃນປະຕິກິລິຍາ NMPylation ຕົນເອງ), ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໂດເມນ NiRAN ໄວຣັສໂຄໂຣນາ (ເປັນຕົວແທນໂດຍ HCoV-229E ແລະ SARS-CoV-2) ສາມາດມີປະສິດທິພາບ. ໂອນທັງສີ່ NMPs, ເຖິງແມ່ນວ່າຈະມີຄວາມມັກເລັກນ້ອຍສໍາລັບ UMP (ຮູບ 1 ແລະ 3).ຄວາມເຂັ້ມງວດຂ້ອນຂ້າງຕໍ່າຂອງ NTP co-substrate ສະເພາະແມ່ນສອດຄ່ອງກັບໂຄງສ້າງ supercomposite SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ທີ່ລາຍງານເມື່ອບໍ່ດົນມານີ້, ເຊິ່ງ ADP-Mg2+ ຜູກມັດກັບສະຖານທີ່ເຄື່ອນໄຫວຂອງ NiRAN, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນກັບ adenine Part. ການສ້າງປະຕິສຳພັນສະເພາະ (17).ໃນການສຶກສາຂອງພວກເຮົາ, ປະເພດຂອງ nucleotide ທີ່ໃຊ້ໃນປະຕິກິລິຍາ NMPylation ບໍ່ມີຜົນກະທົບທີ່ແຕກຕ່າງກັນກ່ຽວກັບກິດຈະກໍາຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ mutant (SI Appendix, ຮູບ S3), ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າບໍ່ມີສານຕົກຄ້າງເຫຼົ່ານີ້ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຜູກມັດຂອງ nucleobase ສະເພາະ.ພື້ນຖານໂຄງສ້າງແລະຄວາມສໍາຄັນທາງຊີວະພາບທີ່ມີທ່າແຮງຂອງຄວາມມັກຂອງ NTP co-substrate ທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ສັງເກດເຫັນຢູ່ໃນໂດເມນ NiRAN ຂອງໂຣກ coronaviruses ແລະເຊື້ອໄວຣັສ arterial ຍັງຄົງຢູ່ໃນການສຶກສາ;ພວກເຂົາເຈົ້າອາດຈະເປັນຄວາມຈິງຫຼືອາດຈະເປັນຍ້ອນຂໍ້ຈໍາກັດຂອງການສຶກສາຂອງເຂົາເຈົ້າ.ໃນປັດຈຸບັນ, ມັນບໍ່ສາມາດປະຕິເສດໄດ້ວ່າກິດຈະກໍາ NMPylator ທີ່ມີທ່າແຮງຂອງໂດເມນ NiRAN ຂອງເຊື້ອໄວຣັສ arterial (ເມື່ອປຽບທຽບກັບກິດຈະກໍາ NMPylation ຂອງຕົນເອງທີ່ມີລັກສະນະກ່ອນຫນ້ານີ້) ມີຄວາມມັກຂອງ substrate ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ໂດຍຄໍານຶງເຖິງຄວາມຄ້າຍຄືກັນລະຫວ່າງເສັ້ນເລືອດແດງແລະໂຣກ coronavirus. ໂດເມນ NiRAN ຢູ່ໃນຂອບເຂດຈໍາກັດຂອງມັນ.ການປຽບທຽບຕາມລໍາດັບ (16).ເມື່ອປຽບທຽບກັບ pseudokinase SelO, ເຊິ່ງໃຊ້ Mg2+ ເປັນ cofactor, ກິດຈະກໍາຂອງໂຣກ coronavirus ແລະເຊື້ອໄວຣັສ arterial NiRAN ແມ່ນຂຶ້ນກັບ Mn2+ (16) (ຮູບ 3C ແລະ SI appendix, ຮູບ S1).ການເອື່ອຍອີງ Mn2+ ແລະຄວາມມັກທີ່ຊັດເຈນສໍາລັບ UTP ແມ່ນລັກສະນະທີ່ຜິດປົກກະຕິຂອງ NMPylators ທາດໂປຼຕີນ, ແລະພຽງແຕ່ບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໃນ YdiU ທາດໂປຼຕີນຈາກ Salmonella typhimurium, ເຊິ່ງ catalyzes Mn2+ ທີ່ເຂັ້ມງວດຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ chaperone UMPylation ເພື່ອປົກປ້ອງຈຸລັງຈາກຄວາມກົດດັນ induction Cell ATP pool ( 33).

ຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງໂຄງສ້າງທີ່ອະທິບາຍເມື່ອໄວໆນີ້ລະຫວ່າງໂດເມນ NiRAN ຂອງໂຣກ coronavirus ແລະ kinases ທາດໂປຼຕີນຈາກເຊນ (17, 19) ສະຫນອງການສະຫນັບສະຫນູນເພີ່ມເຕີມສໍາລັບຄວາມສາມາດຂອງ NiRAN ທີ່ຈະເຊື່ອມໂຍງ NMP ກັບທາດໂປຼຕີນອື່ນໆທີ່ພວກເຮົາໄດ້ລາຍງານໃນການສຶກສານີ້.ພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ການຄົ້ນຫາຂອງພວກເຮົາສໍາລັບເປົ້າຫມາຍ NiRAN ທີ່ເປັນໄປໄດ້ກ່ຽວກັບທາດໂປຼຕີນທີ່ເຂົ້າລະຫັດໂດຍ HCoV-229E ORF1a, ເຊິ່ງເປັນທີ່ຮູ້ຈັກເພື່ອຊ່ວຍເຫຼືອໂດຍກົງຫຼືທາງອ້ອມຂອງ RTC's ORF1b-encode replicase (12, 35).ການທົດລອງຂອງພວກເຮົາໃຫ້ຫຼັກຖານສະຫຼຸບສໍາລັບ NMPylation ທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະສະເພາະຂອງ nsp9 (ຮູບ 2).ຖ້າທາດໂປຼຕີນຈາກເປົ້າຫມາຍຖືກນໍາໃຊ້ໃນ molar ເກີນ 8 ຫາ 10 ເທົ່າຂອງ enzyme (nsp12), ມັນໄດ້ຖືກຢືນຢັນວ່າ nsp9 ແມ່ນສົມບູນ (mono)NMPized (ຮູບ 4).ພວກເຮົາໄດ້ສະຫຼຸບວ່າການໂຕ້ຕອບລະຫວ່າງ nsp12 ແລະ nsp9 ແມ່ນສັ້ນແລະຈະບໍ່ເປັນສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ຫມັ້ນຄົງກັບ nsp9 (ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ RTC ຍ່ອຍອື່ນໆ).ການສະຫລຸບນີ້ແມ່ນໄດ້ຮັບການສະຫນັບສະຫນູນໂດຍການສຶກສາປະຕິສໍາພັນຂອງທາດໂປຼຕີນໃນ proteome SARS-CoV (35).ການວິເຄາະ MS ໄດ້ກໍານົດ amine ຕົ້ນຕໍຂອງ N-terminal residue ຂອງ nsp9 ເປັນສະຖານທີ່ NMPylation (SI appendix, ຮູບ S5).ການສ້າງພັນທະບັດ phosphoramidate ແລະກຸ່ມ N-terminal amino ແຍກແຍະກິດຈະກໍາ NiRAN-mediated NMPylation ຈາກປະຕິກິລິຍາ Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation, ເຊິ່ງກະຕຸ້ນການສ້າງ O-linked AMP ທີ່ Ser, Thr, ຫຼື Tyr residues Peptide adduct ( 22), ແລະ S. typhimurium YdiU ປະກອບເປັນ O-linked (ກັບ Tyr) ແລະ N-linked (ກັບລາວ) peptide-UMP adducts.ຂໍ້​ມູນ​ຈໍາ​ກັດ​ທີ່​ມີ​ຢູ່​ໃນ​ຄອບ​ຄົວ SelO ຂອງ​ໂປຣ​ຕີນ​ຊີ້​ໃຫ້​ເຫັນ​ວ່າ​ສະ​ມາ​ຊິກ​ຂອງ​ຄອບ​ຄົວ​ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ຂະ​ຫນາດ​ໃຫຍ່​ນີ້​ແຕກ​ຕ່າງ​ກັນ​ຢ່າງ​ຫຼວງ​ຫຼາຍ​ໃນ​ການ​ສ້າງ peptide-NMP adducts​.ນີ້ແມ່ນຂໍ້ສັງເກດທີ່ຫນ້າສົນໃຈທີ່ສົມຄວນໄດ້ຮັບການສຶກສາຕື່ມອີກ.

ຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບໃນການສຶກສານີ້ເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າ NMPylation ຂອງ nsp9 ຕ້ອງການ N-terminus ຟຣີ.ໃນສະພາບການຂອງການຈໍາລອງແບບໄວຣັສ, ນີ້ຈະຖືກສະຫນອງໃຫ້ໂດຍການແຕກແຍກ proteolytic ຂອງສະຖານທີ່ປະມວນຜົນ nsp8|nsp9 ຢູ່ໃນ replicase polyprotein pp1a mediated ໂດຍ Mpro ແລະ pp1ab.ໃນໂຣກ coronaviruses ສ່ວນໃຫຍ່, ຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງສະຖານທີ່ສະເພາະນີ້ (VKLQ|NNEI ໃນ HCoV-229E) ແລະສະຖານທີ່ cleavage Mpro ຂອງໂຣກ coronavirus ອື່ນໆທັງຫມົດແມ່ນ Asn (ແທນທີ່ຈະເປັນສິ່ງເສດເຫຼືອຂະຫນາດນ້ອຍອື່ນເຊັ່ນ Ala, Ser Or Gly) ຄອບຄອງ P1â???ສະຖານທີ່ (36).ຂໍ້ມູນ cleavage peptide ທີ່ໄດ້ຮັບໃນການສຶກສາໃນຕອນຕົ້ນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າປະສິດທິພາບການແຕກແຍກຂອງສະຖານທີ່ nsp8|nsp9 ຕ່ໍາກວ່າສະຖານທີ່ອື່ນໆ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ 1) ສະຖານທີ່ສະເພາະນີ້ອາດຈະມີບົດບາດໃນການຄຸ້ມຄອງການປະສານງານທີ່ທັນເວລາຂອງ C-terminal. ພາກພື້ນ pp1a, ຫຼື 2) ບົດບາດຂອງ nsp9 N-terminus ທີ່ຖືກອະນຸລັກພິເສດໃນການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສ (37).ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາ (ຮູບ 5A) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຮູບແບບ recombinant ຂອງ nsp9 ປະຕິບັດລໍາດັບ N-terminal ທີ່ແທ້ຈິງແມ່ນ NMPized ໂດຍ nsp12.ລໍາດັບ N-terminal flanking ໄດ້ຖືກໂຍກຍ້າຍອອກໂດຍປັດໄຈ Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) ຫຼື cleavage Mpro-mediated (nsp7-11-His6; ຮູບ 5A ແລະ SI appendix, ຕາຕະລາງ S1).ສິ່ງສໍາຄັນ, ທາດ precursor nsp9-11-His6 ທີ່ບໍ່ມີການຕັດໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຕ້ານທານກັບ NMPylation ຂອງ nsp12, ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ adduct nsp9-NMP ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍຜ່ານ N-terminal primary amine (SI appendix, ຮູບ S5) .ເພື່ອໃຫ້ມີຄວາມເຂົ້າໃຈເລິກເຊິ່ງກ່ຽວກັບຄວາມສະເພາະຂອງຊັ້ນຍ່ອຍ NiRAN, ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກເຮົາໄດ້ສຸມໃສ່ການຕົກຄ້າງຂອງ N-terminal ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງຂອງ nsp9.ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີທາດໂປຼຕີນອື່ນໆ, ພວກມັນມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນໃນໂຄງສ້າງ, ປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ພວກມັນຖືກກວດພົບໃນຮູບແບບທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ຂອງ nsp9 (26 28, 38), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງທາງທໍາມະຊາດທີ່ຈໍາກັດຂອງພວກມັນ, ນີ້ແມ່ນເນື່ອງມາຈາກລໍາດັບຄວາມສໍາຄັນສະເພາະ (ບໍ່ແມ່ນໂຄງສ້າງຮອງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ) ຟັງຊັນຂອງຊິ້ນສ່ວນ Nsp9 N-terminal.ການທົດແທນ Ala ຂອງສານຕົກຄ້າງທີ່ອະນຸລັກໃນພາກພື້ນນີ້ (ຮູບ 5C ແລະ D ແລະ SI ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ, ຮູບ S8) ເປີດເຜີຍວ່າ N3826 ເປັນສິ່ງຈໍາເປັນສໍາລັບ nsp9 NMPylation ໃນ vitro, ໃນຂະນະທີ່ການທົດແທນ N3825A ແລະ E3827A ນໍາໄປສູ່ການຫຼຸດລົງຂອງ NMPylation, ໃນຂະນະທີ່ M3829A ແລະ P383 ບໍ່ທົດແທນ. .ແນ່ນອນມີຜົນກະທົບ NSP9 NMPylation.ເຖິງແມ່ນວ່າການທົດແທນ N-terminal Asn (N3825A, N3825S) ມີຜົນກະທົບປານກາງຕໍ່ nsp9 NMPylation ແລະການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສໃນວັດທະນະທໍາເຊນ (ຮູບ 5C ແລະ D), ການລຶບລໍາດັບ Asn residue ຈາກ N-terminal 3825-NN dipeptide. ພິສູດແລ້ວວ່າມັນເປັນອັນຕະລາຍຕໍ່ໄວຣັດ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການຕົກຄ້າງຂອງ Asn ຕ້ອງການກ່ອນທີ່ຈະມີ residue ອື່ນຢູ່ທີ່ N-terminus, ດີກວ່າ Asn, ເຖິງແມ່ນວ່າມັນເບິ່ງຄືວ່າການທົດແທນຂອງ residues ທີ່ຄ້າຍຄືກັນສາມາດທົນທານໄດ້ບາງສ່ວນ (ຮູບ 5B, C, ແລະ D).ພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າ 3825-NN dipeptide, ໂດຍສະເພາະແມ່ນການອະນຸລັກແລະສິ່ງເສດເຫຼືອ N3826 ທີ່ສໍາຄັນພາຍໃນຂອບເຂດຂອງໂຣກ coronavirus (SI appendix, ຮູບ S6), ຮັບປະກັນການຜູກມັດທີ່ຖືກຕ້ອງແລະການວາງທິດທາງຂອງ nsp9 N-terminus ໃນສະຖານທີ່ເຄື່ອນໄຫວຂອງ NiRAN.

ການທົດແທນ Ala (E3827A) ສໍາລັບ Glu ທີ່ຖືກອະນຸລັກຂອງ subfamilies ທັງຫມົດຮັກສາ nsp9 NMPylation ໃນ vitro ແຕ່ເປັນຕົວຕາຍຂອງໄວຣັສໃນວັດທະນະທໍາເຊນ (ຮູບ 5C ແລະ D), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຫນ້າທີ່ເພີ່ມເຕີມຂອງສານຕົກຄ້າງນີ້, ສໍາລັບການຍົກຕົວຢ່າງ, ໃນການໂຕ້ຕອບທີ່ສໍາຄັນ (NMPylated ຫຼື unmodified. ) nsp9 N-terminus ແລະປັດໃຈອື່ນໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສ.ການກາຍພັນຂອງ Nsp9 ບໍ່ໄດ້ສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຂະບວນການ proteolytic ຂອງ nsp9 ຫຼື nsps ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງ (39) (SI Appendix, ຮູບ S9), ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ phenotypes ຕາຍຂອງການກາຍພັນ nsp9 ຫຼາຍທີ່ສັງເກດເຫັນບໍ່ໄດ້ເກີດມາຈາກ dysregulation ຂອງ C proteolytic process-terminal pp1a ພື້ນທີ່. .

ຂໍ້ມູນຂ້າງເທິງໃຫ້ຫຼັກຖານວ່າຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວ Mpro-mediated ຂອງ nsp8|9 ສະຖານທີ່ cleavage ໃນ pp1a/pp1ab, N-terminus ຂອງ nsp9 ສາມາດ UMPylated (ຫຼືດັດແກ້ບາງສ່ວນກັບ NMP ອື່ນ).ນອກຈາກນັ້ນ, ການອະນຸລັກທີ່ດີເລີດຂອງ N-terminus ຂອງ nsp9 (ລວມທັງການຕົກຄ້າງ Asn ທີ່ເປັນຕົວແປແລະ invariant ໃນຄອບຄົວໂຣກ coronavirus) ແລະຂໍ້ມູນພັນທຸກໍາປີ້ນກັບກັນທີ່ໄດ້ຮັບໃນການສຶກສານີ້ (ຮູບ 3E ແລະ 5D) ເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າ nsp9 NMPylation ທີ່ໄດ້ອະທິບາຍ. ມີຄວາມກ່ຽວພັນທາງຊີວະພາບ ແລະ ຈຳເປັນຕໍ່ການຈຳລອງຂອງໂຣກ coronavirus.ຜົນສະທ້ອນທີ່ເປັນປະໂຫຍດຂອງການດັດແກ້ນີ້ຍັງຄົງຢູ່ໃນການສຶກສາ, ສໍາລັບຕົວຢ່າງ, ກ່ຽວກັບກິດຈະກໍາການຜູກມັດ RNA (2628) ທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ (ບໍ່ສະເພາະ) (2628).N-terminal NMPylation ອາດຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ປະຕິສໍາພັນຂອງ nsp9 ກັບທາດໂປຼຕີນຫຼື RNA substrates ຫຼືການສ້າງຕັ້ງຂອງສະພາແຫ່ງສີ່ລະດັບທີ່ແຕກຕ່າງກັນ.ເຫຼົ່າ​ນີ້​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ສັງ​ເກດ​ເຫັນ​ໃນ​ການ​ສຶກ​ສາ​ໂຄງ​ສ້າງ​ແລະ​ໄດ້​ຮັບ​ການ​ຢັ້ງ​ຢືນ​ວ່າ​ເປັນ​ການ​ເຮັດ​ວຽກ​ກ່ຽວ​ກັບ​ການ​ຈໍາ​ລອງ​ເຊື້ອ​ໄວ​ຣັ​ສ​ໂຄ​ໂຣ​ນາ, ເຖິງ​ແມ່ນ​ວ່າ​ໂດຍ​ສະ​ເພາະ​ແມ່ນ​ໃນ​ກໍ​ລະ​ນີ​ຂອງ​ການ​ດັດ​ແກ້​ນີ້ (26- â 29, 40).

ເຖິງແມ່ນວ່າຈຸດສະເພາະເປົ້າຫມາຍຂອງໂດເມນ NiRAN ໄວຣັສໂຄໂຣນາຍັງຕ້ອງມີລັກສະນະໃນລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸດສະເພາະເປົ້າຫມາຍທາດໂປຼຕີນຂອງໂດເມນ NiRAN ແມ່ນແຄບຫຼາຍ.ເຖິງແມ່ນວ່າການອະນຸລັກຂອງ residues ສະຖານທີ່ການເຄື່ອນໄຫວທີ່ສໍາຄັນ (8, 16) ໃນໂດເມນ NiRAN ຂອງຄອບຄົວ nidovirus ທັງຫມົດສະຫນັບສະຫນູນຢ່າງແຂງແຮງຂອງກິດຈະກໍາຂອງ NMPylator ອະນຸລັກເຫຼົ່ານີ້, ເອກະລັກຂອງ substrate binding pocket residues ຂອງໂດເມນນີ້ການອະນຸລັກແລະການອະນຸລັກຍັງຄົງມີລັກສະນະ. , ແລະອາດຈະແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງຄອບຄົວທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງຈຸດປະສົງ Nidovirales.ເຊັ່ນດຽວກັນ, ເປົ້າຫມາຍທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງໄວຣັສຮັງອື່ນໆຍັງບໍ່ທັນຖືກກໍານົດ.ພວກເຂົາເຈົ້າອາດຈະເປັນ orthologs ຫ່າງໄກສອກຫຼີກຂອງ nsp9 ຫຼືທາດໂປຼຕີນອື່ນໆ, ເນື່ອງຈາກວ່າລໍາດັບທີ່ຢູ່ນອກຫ້າໂດເມນ replicase ທີ່ຖືກອະນຸລັກໂດຍທົ່ວໄປໃນຮັງໄດ້ຖືກອະນຸລັກຫນ້ອຍ (8), ລວມທັງ genome array ລະຫວ່າງ Mpro ແລະ NiRAN, ໃນບັນດາພວກເຂົາ, nsp9 ແມ່ນຢູ່ໃນ. ​ໄວ​ຣັ​ສ​ໂຄ​ໂຣ​ນາ.

ນອກຈາກນັ້ນ, ໃນປັດຈຸບັນພວກເຮົາບໍ່ສາມາດປະຕິເສດຄວາມເປັນໄປໄດ້ທີ່ໂດເມນ NiRAN ມີເປົ້າຫມາຍເພີ່ມເຕີມ (ລວມທັງໂທລະສັບມືຖື).ໃນກໍລະນີນີ້, ມັນເປັນມູນຄ່າທີ່ກ່າວເຖິງວ່າເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ homologues ໃນທາດໂປຼຕີນທີ່ພົ້ນເດັ່ນຂື້ນນີ້ NMPylators (NMPylators) (30, 31) ເບິ່ງຄືວ່າມີ "ຜູ້ຄວບຄຸມຕົ້ນສະບັບ"?NMP modulates ຄວາມຫລາກຫລາຍຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ cellular ເພື່ອຄວບຄຸມຫຼືລົບລ້າງກິດຈະກໍາທາງລຸ່ມຂອງເຂົາເຈົ້າ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງມີບົດບາດໃນຂະບວນການທາງຊີວະພາບທີ່ຫລາກຫລາຍ, ເຊັ່ນ: ການຕອບສະຫນອງຄວາມກົດດັນຂອງ cellular ແລະ redox homeostasis (22, 33).

ໃນການສຶກສານີ້ (ຮູບ 2 ແລະ 4 ແລະ SI ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ, ຮູບ S3 ແລະ S5), ພວກເຮົາສາມາດພິສູດໄດ້ວ່າ nsp12 ໄດ້ໂອນສ່ວນ UMP (NMP) ໄປຫາຕໍາແຫນ່ງດຽວ (ອະນຸລັກ) ໃນ nsp9, ໃນຂະນະທີ່ທາດໂປຼຕີນອື່ນໆບໍ່ໄດ້ຖືກດັດແປງໃນ. ຖືກນໍາໃຊ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ, ສະຫນັບສະຫນູນຄວາມສະເພາະຂອງ substrate ທີ່ຖືກກໍານົດດີ (ແທນທີ່ຈະວ່າງ) .ສອດຄ່ອງກັບສິ່ງນີ້, ເມື່ອປຽບທຽບກັບ N-terminal nsp9 NMPylation, ກິດຈະກໍາ NMPylation ຂອງຕົນເອງຂອງ nsp12 ແມ່ນຕໍ່າຫຼາຍ, ການກວດພົບຂອງມັນຕ້ອງການເວລາການເປີດເຜີຍ autoradiography ດົນກວ່າ, ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ nsp12 ເພີ່ມຂຶ້ນ 10 ເທົ່າ.ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະ MS ຂອງພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ສະຫນອງຫຼັກຖານສໍາລັບ NMPylation ຂອງ nsp12, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ NiRAN ໂດເມນຕົນເອງ NMPylation ແມ່ນ (ດີທີ່ສຸດ) ເປັນກິດຈະກໍາຂັ້ນສອງ.ຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ມັນຄວນຈະສັງເກດເຫັນວ່າການສຶກສາອື່ນໆໄດ້ສະຫນອງຫຼັກຖານເບື້ອງຕົ້ນວ່າສະຖານະ AMPylation ຕົນເອງຂອງ NMPylator ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍອາດຈະຄວບຄຸມກິດຈະກໍາ NMPylation ຂອງເຂົາເຈົ້າກ່ຽວກັບທາດໂປຼຕີນຈາກຊັ້ນຍ່ອຍອື່ນໆ (22, 33).ດັ່ງນັ້ນ, ການຄົ້ນຄວ້າເພີ່ມເຕີມແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອສືບສວນຜົນກະທົບທີ່ເປັນປະໂຫຍດທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງກິດຈະກໍາ NMPylation ຕົນເອງໄດ້ລາຍງານສໍາລັບ EAV nsp9 (16) ແລະໂຣກ coronavirus nsp12 (ການສຶກສານີ້), ລວມທັງຜົນກະທົບທີ່ຄ້າຍຄື chaperone ທີ່ສະເຫນີກ່ຽວກັບການພັບຂອງໂດເມນ C-terminal RdRp (. 16)).

ກ່ອນຫນ້ານີ້, ຫຼາຍໆສົມມຸດຕິຖານກ່ຽວກັບຫນ້າທີ່ທາງລຸ່ມທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງໂດເມນ nidoviral NiRAN ໄດ້ຖືກພິຈາລະນາ, ລວມທັງ RNA ligase, RNA -capped guanylate transferase ແລະກິດຈະກໍາຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ priming (16), ແຕ່ບໍ່ມີອັນໃດທີ່ເຫມາະສົມກັບຫນ້າທີ່ລຸ່ມນ້ໍາທີ່ມີຢູ່.ຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບໃນຕໍາແຫນ່ງຕໍ່ໄປນີ້ແມ່ນເວລາດຽວກັນຢ່າງແທ້ຈິງໂດຍບໍ່ມີການສົມມຸດຕິຖານເພີ່ມເຕີມ.ຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບໃນການສຶກສານີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບ (ແຕ່ບໍ່ສາມາດພິສູດໄດ້) ວ່າໂດເມນ NiRAN ມີສ່ວນຮ່ວມໃນການເລີ່ມຕົ້ນຂອງການສັງເຄາະ RNA ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນ.ມັນໄດ້ຖືກເຊື່ອວ່າກ່ອນຫນ້ານີ້ຫນ້າທີ່ຂອງໂດເມນ NiRAN ໃນ 5 ??²-RNA capping ຫຼືປະຕິກິລິຍາ ligation RNA ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກການເຫຼົ່ານີ້ແລະການສະຫນັບສະຫນູນຂໍ້ມູນອື່ນໆ.ດັ່ງນັ້ນ, ສໍາລັບການຍົກຕົວຢ່າງ, ສະຖານທີ່ເຄື່ອນໄຫວຂອງ NiRAN ໄດ້ຖືກພິຈາລະນາວ່າມີ Asp ທີ່ຖືກອະນຸລັກເປັນພື້ນຖານທົ່ວໄປ (D252 ໃນ Pseudomonas syringae SelO; D4271 ໃນ HCoV-229E pp1ab; D208 ໃນ SARS-CoV-2 nsp12) (SI ເອກະສານຊ້ອນທ້າຍ, ຮູບ 2. ).S2) (17, 22, 33), ໃນຂະນະທີ່ catalysis ໃນ ATP-dependent RNA ligase ແລະ RNA capping enzyme ແມ່ນດໍາເນີນໂດຍ enzyme covalent-(lysyl-N)-NMP intermediate, ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບການຕົກຄ້າງ Lys ທີ່ບໍ່ປ່ຽນແປງ (. 41).ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມສະເພາະທີ່ອີງໃສ່ລໍາດັບທີ່ໂດດເດັ່ນຂອງ NiRAN ໄວຣັສໂຄໂຣນາສໍາລັບເປົ້າຫມາຍທາດໂປຼຕີນທີ່ຮັກສາໄວ້ແລະຄວາມຈໍາເພາະທີ່ຜ່ອນຄາຍສໍາລັບ NTP co-substrates (ມັກ UTP) ກົງກັນຂ້າມກັບ NiRAN-mediated capping enzyme ຫຼືຫນ້າທີ່ຄ້າຍຄື RNA ligase.

ແນ່ນອນ, ວຽກງານພິເສດຫຼາຍແມ່ນຈໍາເປັນເພື່ອກວດສອບແລະ, ຖ້າພິສູດ, ອະທິບາຍຢ່າງລະອຽດກ່ຽວກັບບົດບາດທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງ nsp9-UMP (nsp9-NMP) ໃນການສັງເຄາະ RNA ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນ, ເຊິ່ງຈະເຊື່ອມຕໍ່ຫຼາຍທີ່ຫນ້າສົນໃຈແຕ່ (ມາຮອດປະຈຸບັນ) ລາຍງານກ່ອນຫນ້ານີ້. .ການສັງເກດການໂດດດ່ຽວ.ຕົວຢ່າງ, ມັນໄດ້ຖືກກໍານົດວ່າການສິ້ນສຸດຂອງສາຍ RNA ທາງລົບຂອງໂຣກ coronavirus ເລີ່ມຕົ້ນດ້ວຍສາຍ oligo (U) (42, 43).ການສັງເກດການນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບຄວາມຄິດທີ່ວ່າການສັງເຄາະຂອງ RNA ສາຍລົບແມ່ນເລີ່ມຕົ້ນໂດຍການຜູກມັດຮູບແບບ UMPylated ຂອງ nsp9 ກັບ poly(A) tail ( triggers), ເຊິ່ງອາດຈະໄດ້ຮັບການສົ່ງເສີມໂດຍການຜູກມັດ RNA ຂອງມັນກິດຈະກໍາແລະ / ຫຼືປະຕິສໍາພັນກັບ. ໂປຣຕີນ RTC ອື່ນ.ສ່ວນ UMP ທີ່ສະໜອງໃຫ້ໂດຍ nsp9 ຫຼັງຈາກນັ້ນສາມາດໃຊ້ເປັນ “primer” ສໍາລັບ nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, ໂດຍໃຊ້ຫາງ 3??²-poly(A) ໃນ genomic RNA ຫຼື ລຳດັບທີ່ບັນຈຸ oligo (A) ອື່ນ. ເຮັດຫນ້າທີ່ເປັນແມ່ແບບ, ຄ້າຍຄືກັນກັບກົນໄກການສ້າງຕັ້ງສໍາລັບທາດໂປຼຕີນຈາກ picornavirus VPg (44).ຈະເປັນແນວໃດຖ້າການສະເຫນີແມ່ນ "ບໍ່ມີມາດຕະຖານ"????ການລິເລີ່ມຂອງການສັງເຄາະ RNA ທາງລົບ (protein-induced) ສະຫນອງການເຊື່ອມຕໍ່ກັບການສັງເກດການ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າໂຣກ coronavirus-strand ລົບ RNA ມີ UMP (ແທນທີ່ຈະເປັນ UTP) ໃນຕອນທ້າຍຂອງມັນ (42), ເຊິ່ງຖືວ່າເປັນການຊີ້ບອກວ່າ ອາຊິດນິວຄລີອິກ Dicer ແຍກສ່ວນທ້າຍ phosphorylated ໂດຍ endonuclease ສະເພາະຂອງ uridine ທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກ.ຖ້າໄດ້ຮັບການຢືນຢັນ, ກິດຈະກໍາ hydrolytic ອາຊິດນິວຄລີອິກນີ້ສາມາດຊ່ວຍປ່ອຍຮູບແບບ UMPylated oligomeric ຂອງ nsp9 ຈາກ 5 ² ປາຍຂອງສາຍລົບທີ່ຕັ້ງຂຶ້ນ.ບົດບາດທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງ nsp9 ໃນການຜະລິດທາດໂປຼຕີນແມ່ນຍັງສອດຄ່ອງກັບການສຶກສາພັນທຸກໍາຍ້ອນກັບທີ່ຜ່ານມາ, ເຊິ່ງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ nsp9 (ແລະ nsp8) ມີປະຕິກິລິຍາທີ່ສໍາຄັນແລະໂດຍສະເພາະກັບອົງປະກອບ cis-acting RNA ທີ່ຖືກອະນຸລັກຢູ່ໃກ້ກັບ 3 ປາຍຂອງ genome ໂຣກ coronavirus.45).ອີງຕາມບົດລາຍງານນີ້, ການສັງເກດການທີ່ຜ່ານມາເຫຼົ່ານີ້ສາມາດຖືກທົບທວນຄືນແລະຂະຫຍາຍໂດຍຜ່ານການຄົ້ນຄວ້າຕື່ມອີກ.

ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາໄດ້ກໍານົດກິດຈະກໍາສະເພາະຂອງແທໍກ enzyme ເຊື້ອໄວຣັສ nested ທີ່ເປັນເຈົ້າຂອງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ RdRp ຢູ່ N-terminus.ໃນໂຣກ coronavirus, ກິດຈະກໍາ NiRAN-mediated UMPylator/NMPylator ນີ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອອີງໃສ່ Mn2+ ແລະ residues Asn ທີ່ຢູ່ໃກ້ຄຽງແລະເຮັດໃຫ້ເກີດການສ້າງພັນທະບັດ phosphoramidate (ພະລັງງານຕ່ໍາ) ກັບ amine ຕົ້ນຕໍ N-terminal.ໂດຍຜ່ານການແຍກຕົວກາງຂອງ Mpro ຢູ່ທີ່ສະຖານທີ່ cleavage nsp8|9, ເປົ້າຫມາຍ nsp9 ສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບ NMPylation, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງການສົມທົບທີ່ເປັນປະໂຫຍດລະຫວ່າງ protease ແລະໂດເມນ NiRAN, ເຊິ່ງຂະຫຍາຍໄປສູ່ RdRp.ການອະນຸລັກສິ່ງເສດເຫຼືອທີ່ສໍາຄັນໃນເວັບໄຊທ໌ທີ່ໃຊ້ nsp12 NiRAN ແລະເປົ້າຫມາຍ nsp9, ສົມທົບກັບຂໍ້ມູນທີ່ໄດ້ຮັບຈາກສອງໂຣກ coronaviruses ລວມທັງ SARS-CoV-2, ສະຫນອງຫຼັກຖານທີ່ເຂັ້ມແຂງວ່າ nsp9 NMPylation ເປັນໂຣກ coronavirus ລັກສະນະການອະນຸລັກຍັງເປັນຂັ້ນຕອນສໍາຄັນໃນການຈໍາລອງເຊື້ອໄວຣັສ.ຂໍ້ມູນທີ່ມີຢູ່ເຮັດໃຫ້ພວກເຮົາສະຫຼຸບວ່າບົດບາດສະເພາະຂອງຮູບແບບ NMPylated ຂອງ nsp9 ໃນການສັງເຄາະ RNA ທີ່ມີທາດໂປຼຕີນແມ່ນເປັນສະຖານະການທີ່ສົມເຫດສົມຜົນສໍາລັບໂຣກ coronavirus ແລະໄວຣັສຮັງອື່ນໆ, ແລະ NiRAN ອາດຈະເປົ້າຫມາຍທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ໄດ້ລະບຸຕົວອື່ນໆ.ຄວບຄຸມໄວຣັດ.ການໂຕ້ຕອບຂອງເຈົ້າພາບ.ຖ້າໄດ້ຮັບການຢືນຢັນ, ການມີສ່ວນຮ່ວມຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ primers ໃນການສັງເຄາະ RNA ໄວຣັສຈະເພີ່ມຄວາມສອດຄ່ອງຂອງລໍາດັບຂອງໂດເມນ Mpro/3CLpro ແລະ RdRp ລະຫວ່າງກຸ່ມ supergroup ທີ່ເປັນໂຣກ coronavirus ແລະ picornavirus ທີ່ຖືກກວດພົບໃນເມື່ອກ່ອນ (9), ເຊິ່ງປະຈຸບັນໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນໃນ Pisonivirites ທີ່ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນເມື່ອໄວໆມານີ້ ( 46) ໃນປະເພດ.

ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າກິດຈະກໍາ enzyme ພື້ນຖານ, ການຄັດເລືອກແລະອະນຸລັກທີ່ລະບຸໄວ້ໃນການສຶກສານີ້ສາມາດນໍາໃຊ້ເປັນເປົ້າຫມາຍຂອງຢາຕ້ານໄວຣັດ.ສານປະສົມທີ່ລົບກວນການຜູກມັດ (ແລະການດັດແກ້ຕໍ່ມາ) ຂອງ Nsp9 N-terminus ທີ່ຖືກອະນຸລັກຢູ່ໃນສະຖານທີ່ເຄື່ອນໄຫວຂອງ NiRAN ສາມາດພັດທະນາເປັນຢາຕ້ານໄວຣັສທີ່ມີປະສິດຕິຜົນແລະຫລາກຫລາຍ, ເຫມາະສົມສໍາລັບການປິ່ນປົວໂຣກ coronaviruses ຂອງສັດແລະມະນຸດຈາກການຕິດເຊື້ອທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ຍ່ອຍ) ສະກຸນ. ລວມທັງ SARS-CoV-2 ແລະໂຣກລະບົບຫາຍໃຈຕາເວັນອອກກາງ Coronavirus.

ລໍາດັບການເຂົ້າລະຫັດຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກໂຣກ coronavirus ທີ່ຜະລິດໃນການສຶກສານີ້ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍອອກໂດຍ RT-PCR ໂດຍໃຊ້ RNA ທີ່ໂດດດ່ຽວຈາກ Huh-7 ທີ່ຕິດເຊື້ອ HCoV-229E ຫຼື Vero E6 ທີ່ຕິດເຊື້ອ SARS-CoV-2, ແລະໃສ່ໂດຍໃຊ້ຂັ້ນຕອນການໂຄນນາມາດຕະຖານ.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) ຫຼື pASK3-Ub-CHis6 (47) expression vector (SI Appendix, Tables S1 and S2).ການທົດແທນ codon ດຽວໄດ້ຖືກນໍາສະເຫນີໂດຍ PCR-based mutagenesis (48).ເພື່ອຜະລິດໂປຣຕີນ fusion MBP, ຈຸລັງ E. coli TB1 ໄດ້ຖືກປ່ຽນແປງດ້ວຍໂຄງສ້າງ pMAL-c2 plasmid ທີ່ເຫມາະສົມ (SI appendix, ຕາຕະລາງ S1).ທາດໂປຼຕີນຈາກ fusion ໄດ້ຖືກຊໍາລະໂດຍ amylose affinity chromatography ແລະຕັດດ້ວຍປັດໄຈ Xa.ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ທາດໂປຼຕິນ His6-tagged C-terminal ໄດ້ຖືກຊໍາລະໂດຍ Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ (49).ເພື່ອຜະລິດໂປຣຕີນ ubiquitin fusion, ຈຸລັງ E. coli TB1 ໄດ້ໃຊ້ໂຄງສ້າງ plasmid pASK3-Ub-CHis6 ທີ່ເຫມາະສົມ (SI Appendix, Tables S1 ແລະ S2) ແລະ pCGI plasmid DNA encoding ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).ການຫັນເປັນ (47).ທາດໂປຼຕີນຈາກໂຣກ coronavirus ທີ່ຕິດຢູ່ C-terminal His6 ໄດ້ຖືກຊໍາລະໃຫ້ບໍລິສຸດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນຫນ້ານີ້ (50).

ການທົດສອບ NMPylation ດ້ວຍຕົນເອງຂອງ HCoV-229E nsp12-His6 ຖືກປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນ EAV nsp9 (16).ໃນສັ້ນ, nsp12-His6 (0.5 µM) ມີ 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 μM buffer. NTP ທີ່ລະບຸໄວ້ ແລະ 0.17 µM ຈັບຄູ່ [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ທີ່ 30 °C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ.ໃນການທົດສອບ NMPylation ອື່ນໆ (ມາດຕະຖານ) ຂອງ nsp12-mediated nsp9 NMPylation, ເງື່ອນໄຂການຕິກິຣິຍາໄດ້ຖືກປັບເປັນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: nsp12-His6 (0.05 µM) ແລະ nsp9-His6 (4 µM) ໃນທີ່ປະທັບຂອງ 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM ຊີ້ໃຫ້ເຫັນ NTP, ແລະ 0.17 µM ຈັບຄູ່ [α32-P]NTP.ຫຼັງຈາກ incubating ເປັນເວລາ 10 ນາທີຢູ່ທີ່ 30 ° C, ຕົວຢ່າງປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກປະສົມກັບ SDS-PAGE buffer ຕົວຢ່າງ: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol ແລະ 0.005% bromool. ສີຟ້າ.ທາດໂປຼຕີນໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຢູ່ທີ່ 90 ° C ເປັນເວລາ 5 ນາທີແລະແຍກອອກໂດຍ 12% SDS-PAGE.ເຈນໄດ້ຖືກສ້ອມແຊມແລະເປັນຮອຍເປື້ອນດ້ວຍການແກ້ໄຂ Coomassie Brilliant Blue (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), decolorized, ແລະສໍາຜັດກັບຫນ້າຈໍຮູບພາບ phosphorescent ສໍາລັບ 20 ຊົ່ວໂມງ (ເພື່ອກວດພົບ nsp12 ຈາກ NMPylation) ຫຼື (ສູງສຸດ) 2 ຊົ່ວໂມງ (ເພື່ອປະເມີນ nsp9 NMPylation).A Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສະແກນຫນ້າຈໍແລະ ImageJ ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວິເຄາະຄວາມເຂັ້ມຂອງສັນຍານ.

ສໍາລັບການວິເຄາະ MS, 1 µM nsp12-His6 ແລະ 10 µM nsp9 (ບໍ່ມີແທໍກ hexahistidine) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການວິເຄາະ NMPylation (SI appendix, ຕາຕະລາງ S1) ແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ 500 µM UTP ແລະ GTP.ອີງຕາມຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນແລະຄຸນນະພາບຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ຄາດໄວ້, ລະບົບ Waters ACQUITY H-Class HPLC ທີ່ຕິດຕັ້ງດ້ວຍຖັນ MassPrep (ນ້ໍາ) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອ desalt 1 ຫາ 10 µL ຂອງການແກ້ໄຂທາດໂປຼຕີນຈາກ buffered ອອນໄລນ໌.ທາດໂປຼຕີນຈາກ desalted ຖືກ eluted ເຂົ້າໄປໃນແຫຼ່ງ electrospray ion ຂອງ Synapt G2Si mass spectrometer (ນ້ໍາ) ໂດຍຜ່ານການ gradient ດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້ຂອງ buffer A (ນ້ໍາ / 0.05% ອາຊິດ formic) ແລະ buffer B (acetonitrile / 0.045% ອາຊິດ formic), ແລະອຸນຫະພູມຖັນແມ່ນ. 60 ° C ແລະອັດຕາການໄຫຼຂອງ 0.1 mL / ນາທີ: elution isocratically ກັບ 5% A ສໍາລັບ 2 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ gradient ເສັ້ນເປັນ 95% B ພາຍໃນ 8 ນາທີ, ແລະຮັກສາ 95% B ສໍາລັບອີກ 4 ນາທີ.

ກວດພົບໄອອອນບວກທີ່ມີລະດັບມະຫາຊົນ 500 ຫາ 5000 m/z.Glu-fibrinopeptide B ຖືກວັດແທກທຸກໆ 45 ວິນາທີເພື່ອແກ້ໄຂການລອຍຕົວແບບອັດຕະໂນມັດ.ໃຊ້ຊອບແວເຄື່ອງມື MassLynx ທີ່ມີສ່ວນຂະຫຍາຍ MaxEnt1 ເພື່ອຕັດສະເປກທຣັມສະເລ່ຍຫຼັງຈາກຫັກເສັ້ນພື້ນຖານ ແລະກ້ຽງ.

UMPylated HCoV-229E nsp9 ໄດ້ຖືກຍ່ອຍສະຫຼາຍໂດຍການເພີ່ມ trypsin (Serva) ທີ່ຖືກດັດແປງຕາມລໍາດັບ (Serva) ແລະ incubated ຄືນຢູ່ທີ່ 37 °C.ຖັນສະປິນ Chromabond C18WP (ເລກສ່ວນ 730522; Macherey-Nagel) ຖືກໃຊ້ເພື່ອລ້າງ ແລະ ສຸມໃສ່ peptides.ສຸດທ້າຍ, peptide ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນນ້ໍາ 25 µL, ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍ 5% acetonitrile ແລະ 0.1% ອາຊິດ formic.

ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ MS ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກມະຫາຊົນ Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).ລະບົບ nanoâ HPLC ສຸດທ້າຍ (Dionex), ຕິດຕັ້ງດ້ວຍການຕິດຕັ້ງ end-mounted 50 cm ??ຖັນ 75 μm C18 RP ບັນຈຸດ້ວຍລູກປັດສະນະແມ່ເຫຼັກ 2.4 μm (Dr. Albin Maisch ປະສິດທິພາບສູງ LC GmbH) ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ spectrometer ມະຫາຊົນອອນໄລນ໌ໂດຍຜ່ານແຫຼ່ງ Proxeon nanospray;ສັກຢາ trypsin 6 µL ເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນຜ່າສູນກາງພາຍໃນ 300 µm × ??1 cm C18 PepMap ຖັນ pre-concentration (Thermo Scientific).ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ນ​້​ໍ​າ / 0.05​% ອາ​ຊິດ formic ເປັນ​ຕົວ​ລະ​ລາຍ​, ຕົວ​ຢ່າງ​ໄດ້​ຖືກ​ດັກ​ອັດ​ຕະ​ໂນ​ມັດ​ແລະ desalinated ໃນ​ອັດ​ຕາ​ການ​ໄຫຼ​ຂອງ 6 µL / ນາ​ທີ​.

ການ gradients ຕໍ່ໄປນີ້ຂອງນ້ໍາ / 0.05% ອາຊິດ formic (ຕົວລະລາຍ A) ແລະ 80% acetonitrile / 0.045% ອາຊິດ formic (ຕົວລະລາຍ B) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອບັນລຸການແຍກຕົວຂອງ tryptic peptides ໃນອັດຕາການໄຫຼຂອງ 300 nL / ນາທີ: 4% B ສໍາລັບ. 5 ນາທີ, ຈາກນັ້ນ 30 A linear gradient ເປັນ 45% B ພາຍໃນນາທີ, ແລະ linear ເພີ່ມຂຶ້ນເປັນ 95% solvent B ພາຍໃນ 5 ນາທີ.ເຊື່ອມຕໍ່ຖັນ chromatographic ກັບສະແຕນເລດ nano-emitter (Proxeon), ແລະສີດ eluent ໂດຍກົງກັບ capillary ຄວາມຮ້ອນຂອງ spectrometer ມະຫາຊົນໂດຍໃຊ້ທ່າແຮງຂອງ 2,300 V. ການສະແກນການສໍາຫຼວດທີ່ມີຄວາມລະອຽດ 60,000 ໃນເຄື່ອງວິເຄາະມະຫາຊົນ Orbitrap ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງ. ດ້ວຍການສະແກນຂໍ້ມູນ MS/MS ຢ່າງໜ້ອຍສາມອັນ, ຖືກຍົກເວັ້ນແບບເຄື່ອນໄຫວເປັນເວລາ 30 ວິນາທີ, ໂດຍໃຊ້ linear ion trap collision induced dissociation ຫຼື high energy collision dissociation ລວມກັບການກວດຫາວົງໂຄຈອນ, ຄວາມລະອຽດແມ່ນ 7,500.


ເວລາປະກາດ: ວັນທີ 03-03-2021